Cardiomyocytes Proliferation Assay Using High Content Screening Analysis System

材料与试剂

1. 1天、30天龄C57BL/6J小鼠（维通利华）
2. 湿盒
3. 组化笔 (abcam, catalog number: ab2601)
4. 盖玻片 (世泰, catalog number: 10212450C)
5. 粘附载玻片 (世泰, catalog number: 188105)
6. 组织包埋盒 (世泰, catalog number: 31050102w)
7. PBS缓冲液粉末pH7.3 (中杉金桥, catalog number: ZLI-9062)
8. PBS缓冲液pH7.4 (gibco, catalog number: C10010500BT)
9. 4%多聚甲醛 (LEAGENE, catalog number: DF0135)
10. 50X EDTA抗原修复液 (LEAGENE, catalog number: YB-23522-1)
11. DEPC水 (LEAGENE, catalog number: NR0001)
12. Tween 20 (Biofroxx, catalog number: 1247ML500)
13. 山羊血清封闭液 (中杉金桥, catalog number: ZLI-9056)
14. TritoTMx-100破膜液 (Sigma-Aldrich, catalog number: X100)
15. 抗体稀释液 (中杉金桥, catalog number: ZLI-9030)
16. pH3抗体 (Millipore, 种属反应性: 小鼠, 人, catalog number: 06-570)
17. α-actinin抗体 (Abcam, 种属反应性: 小鼠,大鼠,人, catalog number: ab9465)
18. Alexa Fluor 488 羊抗兔免疫荧光抗体 (Invitrogen, catalog number: A21206)
19. Alexa Fluor 594 羊抗鼠免疫荧光抗体 (Invitrogen, catalog number: A21203)
    

仪器设备

1. 全自动组织脱水机 (Leica, catalog number: ASP300S)
2. 包埋机 (Leica, catalog number: EG1150H)
3. 石蜡切片机 (Leica, catalog number: RM2235)
4. 展片机 (Leica, catalog number: HI1210)
5. 烤片机 (Leica, catalog number: HI1220)
6. 全自动染色机、封片机 (Thermo Fisher Scientific, catalog number: ClearVue+Gemini)
7. 超纯水设备 (Thermo Fisher Scientific, catalog number: 50136146)
8. 电磁搅拌器 (IKA, catalog number: MS100)
9. 脱色摇床 (海门麒麟医用仪器厂, catalog number: TS-2)
10. 涡旋振荡器 (Scientific Industries, catalog number: SI-0256)
11. 台式高速冷冻离心机 (Eppendorf, catalog number: 5804R) 
12. 移液器 (Eppendorf)
13. 普通4 °C冰箱
14. 共聚焦显微镜 (Zeiss, catalog number: LSM 800)
15. 高内涵筛选分析系统 (Molecular Devices, catalog number: ImageXpress Micro)
    

软件

1. ZEN
2. MetaXpress
   

实验步骤

1. 石蜡切片的制备
   1. 1天、30天龄的C57BL/6J小鼠购买自北京维通利华公司； 
   2. 1天龄小鼠置于冰上麻醉2 min，30天龄小鼠按照0.2ml/20g注射浓度为17.5 μg/ml的三溴乙醇溶液进行麻醉。剪刀剪开小鼠胸腔部分皮肤和皮下组织肌肉层，镊子撑开胸腔，迅速剪下心脏和流出道置于预冷的PBS缓冲液中，剪掉血管连带的多余组织，排出心脏中的血液；
   3. 4%多聚甲醛中固定心脏组织。1天龄小鼠心脏组织固定24 h，30天龄小鼠心脏组织固定48 h。固定结束后将心脏组织置于包埋盒中在流动水下冲水，去除心脏组织中的多聚甲醛液体；
   4. 依据心脏组织大小使用全自动脱水机的不同程序进行脱水，样本依次置于75%、85%、95%和无水乙醇中，随后在二甲苯中透明，最后置于60 °C液态石蜡浸泡；
   5. 使用石蜡包埋机将心脏组织按照胸腔中心脏位置摆放，利用石蜡将心脏组织固定于包埋盒中；
   6. 蜡块置于冰冻机冷冻1小时，展片机预热温度至45 °C，使用Leica石蜡切片机切至心脏最大面，使得心脏腔室完全暴露(图1)，随后按照5 μm厚度进行切割，使得组织切片完全粘附于载玻片，待用。
2. 免疫荧光染色
   1. 组织粘附的载玻片置于烤片机上68 °C烘烤45 min，防止脱片；
   2. 载玻片依次放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各10 min，乙醇浓度为100%、95%、80%、75%、50%中水化5 min，蒸馏水洗5 min；
   3. 提前配制1× EDTA抗原修复液(pH=9.0)于高压锅内煮沸，将心脏组织切片放入高压锅中，使得修复液完全覆盖组织切片，高温修复2 min，流动水下冲洗冷却20 min；
   4. PBST缓冲液冲洗5 min，2次；PBS缓冲液冲洗5 min，3次；
   5. 配制0.3%封闭通透液滴加在心脏组织切片上，室温孵育1 h；
   6. 抗体稀释液稀释pH3一抗与α-actinin一抗滴加到切片组织表面，4 °C过夜；
   7. 一抗孵育16 h后，室温复温1 h；
   8. PBST缓冲液冲洗5 min，2次；PBS缓冲液冲洗5 min，3次；
   9. 按照1:400比例使用PBS稀释Alexa Fluor 594 羊抗小鼠、Alexa Fluor 488 羊抗兔免疫荧光二抗，适量滴加于心脏组织切片上，室温避光孵育1h；
   10. PBST缓冲液冲洗5min，2次；PBS缓冲液冲洗5min，3次；
   11. 含DAPI的封片剂进行封片，注意封片时不能有气泡产生。
3. 荧光共聚焦显微镜成像
   使用荧光共聚焦显微镜进行成像(图2)；
   
4. 高内涵筛选分析系统图像采集
   1. 采用High Content Image Processing Software进行图像采集(图3)，流程如下：
   2. 使用无水乙醇将玻片擦拭干净，晾干后置于高内涵筛选分析系统中进行图像采集与分析；
   3. 打开MetaXpress5.1软件，选择10倍物镜，根据采集对象选择单个玻片采集；
   4. 每个心脏组织框选18 × 18个视野，我们选择DAPI、FITC、Texas Red三个荧光通道，选取一个视野调整荧光通道参数。
   5. 动态拍照状态下选择采集区域；
   6. 采集图像。
   7. 详情见视频附件。
      
      
      
      视频附件
      
      
5. 高内涵筛选分析系统数据分析
   选择采集的图像荧光信号(图3)，选择一个视野分别对三个荧光通道进行参数调整，首先调整“All nuclei”荧光强度圈选出DAPI标记的细胞核，其次根据“GFP”荧光强度圈出pH3+表达位点，最后根据“Texas Red”圈出α-actinin标记的心肌细胞(图4)，统计细胞核中表达pH3的心肌细胞数量即为增殖的心肌细胞数量(图5)。
   详情见视频附件。

结果与分析

1. HE染色展示石蜡切片机切至心脏最大面，心脏四腔室完全暴露(图1)。
   
   
   图1.HE染色展示心脏石蜡切片最大面
   
   
2. 使用共聚焦荧光显微镜对心脏组织切片进行成像，Z轴扫描显示pH3与心肌细胞细胞核共定位(图2)。
   
   
   图2.荧光共聚焦显微镜成像
   哺乳动物出生后1周心肌细胞退出细胞周期(Alkass et al.,2015)，因此，在小鼠出生后1天心肌细胞增殖旺盛，pH3+细胞数量较多；而小鼠出生30天心肌细胞几乎不再增殖，pH3+心肌细胞无法被检测到。
   
   
3. 高内涵筛选分析系统分别采集心脏组织切片中DAPI、FITC、Texas Red荧光标记的图像流程及采集的荧光信号。按照图3A所示流程依次设置图像采集区域，分别将DAPI标记的细胞核、pH3标记的增殖点、α-actinin标记的心肌细胞荧光信号调至清晰焦面。
   
   
   图3. 高内涵筛选分析系统图像采集流程及采集荧光图像。A.图像采集流程界面；B.DAPI标记的细胞核；C.pH3标记的增殖细胞；D. α-actinin标记的心肌细胞；E. 三通道叠加。
   
   
4. 分析采集图像的荧光信号。
   在图4中，选择一个图像视野，分别圈出DAPI标记细胞核、pH3标记细胞增殖点、α-actinin标记心肌细胞的荧光信号。如上图所示，A(左)为分析DAPI标记荧光信号的参数设置，A(中)为DAPI标记荧光信号的采集图像，A(右)为分析DAPI标记荧光信号的圈选区域；B(左)为分析pH3标记荧光信号的参数设置，B(中)为pH3标记荧光信号的采集图像，B(右)为分析pH3标记荧光信号的圈选区域；C(左)为分析α-actinin标记荧光信号的参数设置，C(中)为α-actinin标记荧光信号的采集图像，C(右)为分析α-actinin标记荧光信号的圈选区域。
   
   
   图4. 荧光信号图像数据分析设置。DAPI荧光信号数据分析；B. pH3荧光信号数据分析；C. α-actinin荧光信号数据分析。
   
   
5. 所采集图像的荧光信号分析结束后，系统自动计算pH3+心肌细胞数量所占比例，格式如下：
   采集图像的荧光信号分析结束后，根据DAPI、FITC、Texas Red三通道定位情况，计算细胞核中表达pH3的心肌细胞数量，得出如图5所示的结果。“Subtotal Profile 1XX”表示DAPI染细胞核的数量为1156，“Subtotal Profile 12X”表示DAPI与pH3共定位的细胞数为18，“Subtotal Profile 1X3”表示细胞核完整的心肌细胞数量为103，“Subtotal Profile 123”表示细胞核表达pH3的心肌细胞数为9，则增殖的心肌细胞比例为表达pH3的心肌细胞数量与所有的心肌细胞数量之比。
   
   
   图5. 高内涵筛选分析系统分析数据结果格式
   

溶液配方

1. 1× EDTA抗原修复液
   将50×的EDTA抗原修复液20 ml加入到980 ml超纯水中配制为1× EDTA抗原修复液待用；
2. 0.3%封闭通透液
   将3 μl TritoTMx-100破膜液加入到1 ml山羊血清封闭液中配制为0.3%封闭通透液；
3. PBST缓冲液
   将23 g PBS粉末加入到2 L超纯水中，搅拌至粉末全部溶解，液体澄清，为PBS缓冲液；将2 ml Tween-20加入到PBS缓冲液中，搅拌至澄清，为PBST缓冲液。
   

致谢

感谢中国医学科学院阜外医院心血管疾病国家重点实验室高精光学技术平台老师的大力支持。感谢国家自然科学基金面上项目(NO. 81770308)基金资助。该实验方案已在Li et al. (2020)、Wang et al. (2020)等人发表文章中使用。

参考文献

1. Alkass, K., Panula, J., Westman, M., Wu, T.D., Guerquin-Kern, J.L. and Bergmann, O. (2015). No Evidence for Cardiomyocyte Number Expansion in Preadolescent Mice. Cell 163: 1026-1036.
2. Li, Y., Feng, J., Song, S., Li, H., Yang, H., Zhou, B., Li, Y., Yue, Z., Lian, H., Liu, L., Hu, S. and Nie, Y. (2020). gp130 Controls cardiomyocyte proliferation and heart regeneration. Circulation 142(10): 967-982.
3. Wang, Y., Li, Y., Feng, J., Liu, W., Li, Y., Liu, J., Yin, Q., Lian, H., Liu, L. and Nie, Y. (2020). Mydgf promotes Cardiomyocyte proliferation and Neonatal Heart regeneration. Theranostics 10(20): 9100-9112.