In Vitro Antifungal Activity Test

材料与试剂

1. 15 ml玻璃摇菌管 (上海泰坦科技股份有限公司)
2. 1.5 ml 离心管 (上海越夷生物科技有限公司)
3. 50 ml离心管 (上海越夷生物科技有限公司)
4. 血球计数板 (上海泰坦科技股份有限公司)
5. 6孔 (或24孔)、96孔细胞培养板 (Corning) (康宁生命科学(吴江)有限公司)
6. DMSO (翌圣生物科技(上海)股份有限公司)
7. PBS缓冲溶液 (见溶液配方)
8. YEPD培养液 (见溶液配方)
9. RPMI 1640培养液 (见溶液配方)
   

仪器设备

1. 医用低温保存箱 (青岛海尔特种电器有限公司，型号：DW-86W100J)
2. 生物安全柜 (苏州安泰空气技术有限公司，型号：BSC-1004ⅡA2)
3. 数显气浴恒温振荡器 (上海博迅医疗生物仪器股份有限公司，型号：THZ-92A)
4. 精密分析电子天平 (梅特勒-托利多仪器上海有限公司，型号：ME204E)
5. 空冷型台式高速离心机 (上海泰坦科技股份有限公司，型号：HDC-15K)
6. 低速离心机 (大龙兴创实验仪器北京有限公司，型号：DM0412)
7. 旋涡混合器 (海门市其林贝尔仪器制造有限公司，型号：VORTEX-5)
8. 生物显微镜 (北京测维光电技术有限公司，型号：LW100T)
9. 霉菌培养箱 (上海一恒科学仪器有限公司，型号：MJ-150-I)
10. 酶标仪 (赛默飞世尔上海仪器有限公司，型号：Thermo Multiskan FC)
11. 微量可调移液器 (德国艾本德上海股份公司，型号：Eppendorf Research plus 单道可调量程移液器：10 μl/100 μl/1000 μl，8道可调量程移液器：300 μl/道)
    

实验步骤

1. 待测化合物的配制：将待测化合物用DMSO配制成2 mg/ml的母液。
2. 待测菌株的活化：于-80 °C低温保存箱中取出冻存的待测菌株，吸取10 μl菌液加入装有1 ml YEPD培养液的玻璃摇菌管中，置于30 °C气浴恒温振荡培养箱中，200 rpm/min振荡培养。24 h后从YEPD菌悬液中吸取10 μl加入到新的1 ml YEPD培养液中，继续30 °C振荡培养16 h，活化完成，此时的真菌即处于指数生长末期。
3. 菌悬液的配制：取处于指数生长末期的待测菌株置于1.5 ml离心管中，离心 (3000 rpm，1 min)，吸弃上清液，使用1 ml PBS缓冲溶液洗涤菌株，离心 (3000 rpm，1 min)，吸弃上清液，重复洗涤3次。取10 μl真菌原液稀释100倍后使用血球计数板于生物显微镜下计数，计算出真菌原液的菌浓度，然后用RPMI 1640培养液稀释配制成实验所需浓度 (1 ×10³ CFU/ml) 的菌悬液。
   
4. MIC₈₀的测定1-5：采用美国临床实验室标准化协会 (Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI) M27-A3和M38-A2文件所推荐的微量液基稀释法进行测定，并通过培养物的光密度值(OD)来评价真菌的生长情况，以此考察化合物对真菌的体外抑制活性。如图1所示，将配制好的菌悬液涡旋均匀后转移至96孔细胞培养板的B-G行中，第1列每孔加入200 μl，第2-11列每孔加入100 μl。将配制好的待测化合物溶液分别加入第1列的B1-D1和E1-G1孔中，作三复孔，每孔加入6.4 μl待测化合物使其终浓度为64 μg/ml。各列从左到右依次进行倍半稀释使得第1-10列的化合物终浓度分别为64-0.125 μg/ml。第11列各孔中为未加任何药物作用的菌悬液，作为阴性对照组。96孔细胞培养板最外周即第12列、A行和H行各孔中加入空白的RPMI 1640培养液，作为空白对照组。将96孔细胞培养板置于30 °C恒温培养箱中静置培养，48 h后 (隐球菌培养时间为72 h) 使用酶标仪测定每孔真菌在630 nm处的光密度值OD₆₃₀。以阴性对照组的OD₆₃₀值为100%，依据抑菌率 (%) 公式 (1) 计算各孔对应的不同药物浓度下化合物的抑菌率 (%)，抑菌率 (%) ≥ 80%时所对应的最小浓度即为该化合物的最低抑菌浓度值 (MIC₈₀)。
   抑菌率(%)的计算公式为：
   抑菌率(%) = (OD₆₃₀阴性对照组 － OD₆₃₀药物组)/(OD₆₃₀阴性对照组 － OD₆₃₀空白对照组) × 100%        (1)
   
   
   图1. MIC的测定实验中96孔板的布局图。其中，红色：空白RPMI1640，作为空白对照；蓝色：未加任何药物作用的菌悬液，作为阴性对照；黑色：加待测药物作用的菌悬液。
   
   
5. FICI的测定6-11：采用CLSI推荐的棋盘式微量液基稀释法（棋盘法）进行测定，并通过培养物的光密度值（OD）来评价真菌的生长情况，以此考察化合物对真菌的体外协同抑制活性。将配制好的菌悬液涡旋均匀后转移至6孔细胞培养板中，第1孔加入2.6 ml，第2-6孔每孔加入1.3 ml。取83.2 μl待测化合物溶液加入第1孔中使其终浓度为64 μg/ml，依次进行倍半稀释使得第1-6孔中的化合物终浓度分别为64-2 μg/ml。如图2所示，将在6孔细胞培养板中配制好的含药菌悬液按化合物浓度从高到低 (64-2 μg/ml) 依次对应转移至96孔细胞培养板的A-F行中，第1列每孔加入200 μl，第2-10列每孔加入100 μl。第11列的A11-F11孔和第G行的G1-G9孔中加入未加药的空白菌悬液，100 μl/孔。将配制好的FLC溶液分别加入第1列的A1-G1孔中，每孔加入6.4 μl使其终浓度为64 μg/ml。各列从左到右依次进行倍半稀释使得第1-9列的FLC终浓度分别为64-0.25 μg/ml。96孔细胞培养板第11列的A11-F11孔中为未加任何药物作用的菌悬液，作为阴性对照组。第12列和H行各孔中分别加入100 μl的RPMI 1640培养液，作为空白对照组。将96孔细胞培养板置于30 °C恒温培养箱中静置培养，48 h后 (隐球菌培养时间为72 h) 使用酶标仪测定每孔真菌在630 nm处的光密度值OD₆₃₀。以阴性对照组的OD₆₃₀值为100%，依据抑菌率 (%) 公式 (1) 计算各孔对应的不同药物浓度下化合物的抑菌率 (%)，根据化合物和FLC单用或联用时的MIC80值计算协同指数FICI (公式2)。
   FICI的计算公式为：
   FICI = MIC_{80化合物(联用)}/MIC_{80化合物(单用)} + MIC_{80 FLC(联用)}/MIC_{80 FLC(单用)}          (2)
   注：FICI < 0.5，说明化合物与阳性药具有协同作用；FICI > 4，说明化合物与阳性药具有拮抗作用；0.5 ≤ FICI ≤ 4, 说明化合物与FLC之间无相关作用。
   
   
   图2. FICI的测定实验中96孔板的布局图。其中，红色：空白RPMI1640，作为空白对照；蓝色：未加任何药物作用的菌悬液，作为阴性对照；绿色：只加阳性药FLC作用的菌悬液；粉色：只加待测药物作用的菌悬液；黑色：加待测药物与阳性药物协同作用的菌悬液；灰色：G10-G11为未加菌悬液的空白孔。

注意事项

1. PBS缓冲液和培养液的配制和储存过程须保证无菌。
2. 实验须在生物安全柜中进行，保证无菌操作，避免染菌导致实验失败。
3. 倍半稀释的操作需规范，防止数据跳孔。
   

溶液配方

1. PBS缓冲溶液
NaCl：8.0 g，Na₂HPO₄·12H₂O：3.57 g，KCl：0.20 g，KH₂PO₄：0.24 g，以超纯水定容至1,000 ml，经高压蒸汽灭菌(121 °C，15 min)，后于室温保存备用。
2. YEPD培养液
酵母浸膏：10.0 g，蛋白胨：20.0 g，D-葡萄糖：20.0 g，加超纯水800 ml溶解，再以超纯水定容至1,000 ml，经高压蒸汽灭菌(121 °C，15 min)，自然冷却至室温，后于4 °C保存备用。
3. RPMI 1640培养液
RPMI 1640 (Gibco BRL)：10.0 g，NaHCO₃：2.0 g，3-吗啉丙磺酸(MOPS)：34.5 g，NaOH：2.7 g，以超纯水定容至1,000 ml，经0.45 μm、0.22 μm微孔滤膜抽滤灭菌，后于4°C保存备用。

致谢

感谢国家自然科学基金 (81973175，81725020) 和上海市教委科技创新重大项目(2019-01-07-00-07-E00073) 的资助。已发表的使用过本实验方案的研究论文请见参考文献。

参考文献

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2. Ji, C. J., Liu, N., Tu, J., Li, Z., Han, G. Y., Li, J. and Sheng, C. Q. (2020). Drug Repurposing of Haloperidol: Discovery of New Benzocyclane Derivatives as Potent Antifungal Agents against Cryptococcosis and Candidiasis. ACS Infect Dis 6: 768-786.
3. Li, C. L., Liu, Y., Wu, S. C., Han, G. Y., Tu, J., Dong, G. Q., Liu, N. and Sheng, C. Q. (2020). Targeting fungal virulence factor by small molecules: Structure-based discovery of novel secreted aspartic protease 2 (SAP2) inhibitors. Eur J Med Chem 201: 112515.
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