Lysosomal Localization and Lysosomal Membrane Permeability Assay of Small Molecules by LmageXpress Micro XLS

材料与试剂

1. 细胞株 (SGC-7901) (中山大学细胞库)
2. 胎牛血清 (FBS) (美国Gibco公司, catalog number: 10270106)
3. 新生牛血清 (NBCS) (美国Gibco公司, catalog number: 16010142)
4. RPMI-1640培养液 (美国Gibco公司, catalog number: 31870082)
5. DMEM高糖培养液 (美国Gibco公司, catalog number: 11965092)
6. 溶酶体红色荧光探针 (Beyotime生物技术有限公司, catalog number: C1046)
7. 吖啶橙 (AO) (Beyotime生物技术有限公司, CAS number:: 494-38-2)
8. 青霉素/链霉素 (Beyotime生物技术有限公司, catalog number: C0222)
9. RPMI-1640/DMEM (Gibco) 的配制 (见溶液配方, catalog number: 31800022/12800017 )
   

仪器设备

1. 超净工作台(苏洁医疗器械有限公司, model: SJ-CJ-2FD)
2. 二氧化碳培养箱 (日本松下电器公司, model: 371)
3. 倒置生物显微镜 (奥林巴斯公司, model: CKX31-A11RC)
4. 立式压力蒸汽灭菌器 (上海申安医疗器械厂, model: LDZM-60KCS-II)
5. 电热鼓风干燥箱 (上海凯朗仪器设备厂, model: DHG-9140A)
6. 低速离心机 (上海安亭科学仪器厂, model: TDL-5-A)
7. 高速冷冻离心机 (上海卢湘仪仪器有限公司, model: TGL-16M)
8. -86 °C医用低温箱 (日本松下公司, model: MDF-193)
9. 高内涵细胞成像系统 (MOLECULAR DEVICES, model: ImageXpress Mcro XLS)

实验步骤

一、溶酶体定位及溶酶体膜透性检测

1. 将细胞置于12孔微量分析培养板 (NEST) 中。
2. 待细胞长至40%-60%，加药 (3.5 μM ) 作用1-2 h。
3. 细胞与染液LysoTracker Red (150 nM，λex = 577 nm，λem = 590 nm)在37 °C孵育1 h。
4. 孵育完成后，将孔板用4 °C PBS洗涤3次。
5. 洗涤完毕后，在所有孔中加入300-500 μL/孔PBS，将细胞在高内涵成像分析系统下成像。
   
   5.1

   开机
   高内涵分析系统如图1

   1)

   插电源并且打开光源等开关 (三个开关朝上，皆亮绿灯)。

   2)

   开电脑主机和电脑显示屏。

   3)

   打开软件Matepress，输入密码：MOLDEV。
   
   
   图1. 高内涵成像分析系统外观图
   

   
   
   5.2

   批量拍照步骤(适用于仪器稳定，细胞培养板平整的情况)
   高内涵成像分析系统操作界面图2
   

   1)

   点击开窗按钮，取下细胞培养板的盖子，板孔A对应板孔槽的右上角，放入细胞培养板，关窗。

   2)

   点击screening → 点第一个选项：选择File名称 → 选中需要拍摄的板孔和视野 (选中即为绿色，视野最好不少于20个，五点取样)。

   3)

   点击configure → 选取板孔样式：plate-celler 12-well-plastic或者是plate-celler 6-well-plastic (此处应根据所购买的细胞培养板的种类做适宜更改，选择合适的板孔样式)。

   4)

   选择需要拍照的通道数目及范围：绿光 (FITC)、红光 (Texas Red)、蓝光(DAPI)、明场 (TL ON)。

   5)

   选中所要拍摄的某个通道 → 自动曝光 (Auto exposure) → 自动聚焦 (calculated offect，曝光值较大时此过程会较为缓慢) → 聚焦完毕后，弹出对话框，拉动进度条选择最为清楚的一张照片 → OK → 以同样的方法调整好每个通道的清晰度 → 点preview即可预览。

   6)

   点击run → 更改folder Name (例如：GYY AOEB 20200624) → 复制folder Name，粘贴到下一行 → 点击Acquire plate 后开始拍照。从第一个板孔开始按“S”型进行拍照，若曝光值较大，则此过程较为缓慢；若一开始选择了12个板孔和20个视野，则每个板孔各拍摄20张图片，一共拍摄240张照片，第1-20张图片属于第一个板孔，第21-40张属于第二个板孔以此类推。
   
   
   图2. 高内涵成像分析系统操作界面图
   
   
   
   5.3

   批量保存图片 (适用于保存批量拍摄的图片)
           拍摄完毕 → 点击screening → 再点击review plate → 点击select plate → 按拍摄时间和命名选中所需文件 → 勾选“all”，并勾绿所有板孔 →选择所拍摄的所有通道如→点击display→勾选 →点击Load select images →随后弹出图片 →右击 save as →选择所要保存的文件夹 →改格式TIFF File Format （*.tif） → 改前缀G-、R-、B-等等以区分各个通道图片。
   5.4

   单独拍摄保存照片(适用于仪器不够稳定及细胞培养板不平整的情况)
   高内涵成像分析系统数据保存操作如图3
           与批量拍照步骤类似，打开configure，根据所要拍摄的通道在最上方选择合适的模板 (如hm ROS、wyj等等)，在根据个人铺板的情况选中所要拍摄的板孔和视野，先点击Auto exposure自动曝光，然后点击calculate offect自动聚焦，在弹出的对话框中选择最清晰的一张照片，点击OK。若此时照片还是不够清晰，则可缓慢调节自动聚焦后的参数，使图片更为清晰。或者把实时Live打开，缓慢调节z坐标轴，直至调出清晰的图片。
           调出清晰的图片后，单独保存图片则遵循如下步骤：点击Edit → display →Overlay Images →此刻弹出对话框 →按所要保存的通道选择合适的选项(例如保存FITC通道图片则只选择FITC，其他通道选择None；若同时选择FITC与DAPI通道则保存的是两个通道下的叠加图) → 点击Apply → 右击Save as → 命名保存于合适的文件夹 → 后面则可换孔、换视野继续如上操作
   
   
   图3. 高内涵成像分析系统数据保存操作图
   
   
   5.5

   关机步骤
   拍摄完毕，点击开窗按钮，取出拍摄的细胞培养板，随后关窗，防止镜头落灰。退出软件，用专用的U盘获取拍摄的数据，关闭计算机主机和显示屏。关闭灯源等三个开关 (绿灯灭)，最后拔掉计算机插头和光源插头 (荧光显微镜插头不拔)。
   
   
   

二、溶酶体定位及溶酶体膜透性检测

1. 将细胞置于12孔微量分析培养板 (NEST) 中。
2. 待细胞长至40%-60%，加药 (3.5μM ) 作用4-8 h。
3. 细胞与AO (1 μg/ml) 在37 °C孵育1 h。
4. 孵育完成后，将孔板用4 °C PBS洗涤3次。
5. 洗涤完毕后，所有孔加入300-500 μL/孔PBS，将细胞在高内涵成像分析系统下成像(具体操作见第一点)。
   

结果与分析

1. 溶酶体定位及溶酶体膜透性检测
           溶酶体中含有多种水解酶，能够降解几乎所有的生物分子。溶酶体完整性的破坏可导致溶酶体膜通透性 (LMP) 启动细胞死亡 (Boyaet al., 2003; Nylandstedet al., 2004; Blomgranet al., 2007; Boya and Kroemer, 2008; Repnik et al., 2014)。用LysoTracker Red染色法检测配位化合物在溶酶体中的位置。如图4（A）所示，用LysoTracker Red染色的溶酶体显示亮红色。SGC-7901细胞暴露于3.5 μg/ml的配位化合物1-3后，配位化合物发射绿色荧光。合并暗示红色和绿色荧光重叠，表明配位化合物1-3靶向溶酶体。
           然后用吖啶橙 (AO) 染色法观察溶酶体通透性。AO是一种异色荧光染料，在酸性pH下 (在完整溶酶体中) 表现出明亮的红色荧光。当溶酶体通透性增强，进入溶酶体的AO红色荧光逐渐减弱 (Changet al., 2016)。如图4（B）所示，在对照组 (a) 中，发现绿色荧光包含多个明亮的红色荧光点。3.5 μg/ml的配位化合物1 (b)、2 (c) 和3 (d) 处理SGC-7901细胞24 h后红色荧光减弱，表明溶酶体通透性增强。
           吖啶橙 (AO) 能透过核膜完整的细胞，与细胞DNA结合，使之发出明亮的绿色荧光，当细胞发生早期凋亡时，吖啶橙 (AO) 能透过胞膜完整的早期凋亡细胞，早期凋亡细胞常伴有核固缩 (Taylor et al., 2008; Marinoet al., 2014; Caoet al., 2017)。如图4B所示，在对照组 (a) 中，发现SGC-7901细胞显现明亮的绿色荧光且细胞核结构完整，细胞核呈正常的米粒状。3.5 μg/ml配位化合物1 (b)、2 (c) 和3 (d) 处理SGC-7901细胞24 h导致核固缩，表现明显的凋亡特征，例如：细胞膜起泡、核固缩、染色质凝结。
   
   
   图4. A. SGC-7901细胞用3.5 μM的复合物1-3处理1小时后，复合物在溶酶体的位置。B. SGC-7901细胞（a）加入3.5 μM的复合物1（b）、2（c）和3（d）8小时后，溶酶体通透性的检测，细胞用AO进行染色。

溶液配方

1. RPMI-1640/DMEM (Gibco) 的配制
   
   1.1

   高压1 L超纯水、过滤装置、玻璃棒、1 L烧杯。
   1.2

   称取2.0 g碳酸氢钠 (调PH)，青霉素-链霉素双抗解冻。
   1.3

   将高压的1 L超纯水、过滤装置、玻璃棒、烧杯，RPMI-1640/DMEM粉末一包放于超净台紫外1 h。
   1.4

   进入超净台进行溶液配制，先倒一瓶高压后的超纯水于1 L烧杯中，后加入RPMI-1640/DMEM粉末、碳酸氢钠2.0 g、青霉素-链霉素双抗10 ml，充分溶解后加入另一瓶超纯水。
   1.5

   搭过滤装置并且检查过滤装置是否漏液。
   1.6

   将滤液分装于两个500 ml玻璃瓶内，用封口膜封口，随后拿出超净台放入4 °C冰箱。

致谢

        这项工作得到了中国国家自然科学基金的支持 (No 21877018)。

参考文献

1. Boya, P., Andreau, K., Poncet, D., Zamzami, N., Perfettini, J. L., Metivier, D., Ojcius, D. M., Jaattela, M., Kroemer, G. (2003). Lysosomal membrane permeabilization induces cell death in a mitochondrion-dependent fashion. J Exp Med 197: 1323-34.
2. Blomgran, R., Zheng, L., Stendahl, O., (2007). Cathepsin‐cleaved Bid promotes apoptosis in human neutrophils via oxidative stress‐induced lysosomal membrane permeabilization. J Leukoc Biol 81: 1213-23.
3. Boya, P., Kroemer, G. (2008). lysosomal membrane permeabilization in cell death. Oncogene 27: 6434-6451.
4. Chang, Y., Li, Y., Ye, N., Guo, X., Li, Z., Sun, G., Sun, Y. (2016). Atorvastatin inhibits the apoptosis of human umbilical vein endothelial cells induced by angiotensin II via the lysosomal-mitochondrial axis. Apoptosis 21: 977-996.
5. Cao, J. J., Tan, C. P., Chen, M. H., Wu, N., Yao, D. Y., Liu, X. G., Ji, L. N., Mao, Z. W. (2017). Targeting cancer cell metabolism with mitochondria-immobilized phosphorescent cyclometalated iridium (III) complexes. Chem Sci 8: 631-640.
6. Marino, G., Niso-Santano, M., Baehrecke, E. H., Kroemer, G., (2014). Self-consumption: the interplay of autophagy and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol 15: 81-94.
7. Nylandsted, J., Gyrd-Hansen, M., Danielewicz, A., Fehrenbacher, N., Lademann, U., Hoyer-Hansen, M., Weber, E., Multhoff, G., Rohde, M. (2004). Heat shock protein 70 promotes cell survival by inhibiting lysosomal membrane permeabilization. J Exp Med 200: 425-35.
8. Repnik, U., Hafner Cesen, M., Turk, B. (2014). Lysosomal membrane permeabilization in cell death: concepts and challenges. Mitochondrion 19: 49-57.
9. Taylor, R. C., Cullen, S. P., Martin, S. J., (2008). Apoptosis: controlled demolition at the cellular level. Nat Rev Mol Cell Biol 9: 231-41.