Demethylation Activity Validation of the DNA Methylation Inhibitors in Reporter Cell Line

材料与试剂

1. 100 mm Cell Culture Dish with Clear Lid, Sterile (NEST, catalog number: 704001)
2. CellCarrier-96 Black, Optically Clear Bottom, Tissue Culture Treated (PerkinElmer, catalog number: 6005550)
3. Poly-D-Lysine (PDL) (Beyotime, catalog number: C0312)
4. Hoechst 33342 (Beyotime, catalog number: C1022, stored at -80 °C)
5. DMEM medium (Hyclone, catalog number: SH30243.01, stored at 4 °C)
6. Fetal Bovine Serum (Biological Industries, catalog number: 04-001-1ACS, stored at -80 °C)
7. Penicillin-streptomycin (ThermoFisher, catalog number: 15140148, stored at 4 °C)
8. Decitabine (Selleck, catalog number: S1200, aliquoted and stored at -80 °C)
9. DMSO (MP Biomedicals, catalog number: 196055)
10. 1x DPBS (ThermoFisher, catalog number: 14190144)
11. Trypsin-Versene mixture (Lonza, catalog number: 17-161E, stored at 4 °C)
12. Trypan Blue 0.04% solution (Gibco, catalog number: 15250061)
13. DMEM培养基 (见溶液配方)
14. PDL溶液 (见溶液配方)
15. Hoechst 33342工作溶液 (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 二氧化碳细胞培养箱 (Memmert, CO2 incubator ICO50)
2. 无菌超净工作台 (ESCO, model: AC2-4S1)
3. 水平转子低速离心机 (ThermoFisher, model: Labofuge 400)
4. 八连排移液枪 (ThermoFisher, model: 14-386-352N))
5. Bright Line Hemocytometer (Weber Scientific, model: 3048-11)
6. Opera Phenix High-Content Screening System (PerkinElmer, model: HH14000000)
   

实验步骤

一、铺被PDL

1. 使用紫外线照射30 min对超净工作台进行灭菌。
2. 准备终浓度为0.1 mg/ml的PDL溶液用于处理96孔板CellCarrier-96 (黑色透明底)。
3. 用八连排移液枪向每孔中加入约40 μl 的PDL溶液，轻轻晃动使其润湿底部。
4. 室温孵育30 min后吸弃。
   
   

二、B2-17报告细胞系计数

1. 吸弃10 cm细胞培养板中的培养基，加入4 ml DPBS溶液，前后左右轻轻晃动后吸弃。
2. 加入1.5 ml Trypsin溶液，轻轻晃动后室温消化1 min。
3. 加入1.5 ml DMEM培养基终止消化并吹吸几下，将细胞吹散为单细胞。
4. 室温800 × g 离心3 min。吸弃上清后加入1 ml DMEM培养基重悬，另准备一只离心管将细胞悬液以1:5稀释于其中。
5. 取90 μl稀释后的细胞悬液，加入10 μl Trypan Blue溶液。
6. 使用Hemocytometer进行细胞计数。
   
   

三、接种B2-17报告细胞系

1. 将细胞悬液使用DMEM培养基梯度稀释为终浓度为6,000 cell/ml的稀释液。
2. 使用排枪向经PDL预处理的96孔板中加入细胞稀释液，每孔中加入200 μl (最终每孔约1,200 cells)。可设置2-3个技术重复孔，或另单独重复做2次生物学重复实验，用于统计分析。
3. 将96孔板暂时放置于二氧化碳培养箱中。
   
   

四、化合物处理细胞

1. 梯度稀释化合物，以阳性化合物decitabine为例。
2. 使用DMSO对decitabine以1:2的倍比进行梯度稀释，从31.25 μM至16 mM共十种浓度。
3. 向96孔板细胞中以1:200的比例加入待检测化合物，如阴性对照DMSO和阳性化合物decitabine等。decitabine的终浓度为0.15625 μM至80 μM，2倍倍比梯度，共十种浓度。
4. 前后左右多次晃动96孔板以混匀化合物，必要时可用排枪轻柔吹吸混匀，避免吹打出气泡。将96孔板放置于37 °C，5% CO2二氧化碳培养箱中培养4 d。
   
   

五、Hoechst染色

1. 使用DPBS将hoechst 33342稀释至终浓度5 μg/ml。如拍照样品较多时间长，可将浓度降低到1 μg/ml。
2. 吸弃96孔板中的培养基 (包含化合物)，可贴着96孔侧壁吸弃以避免吸起细胞。
3. 将稀释后的hoechst溶液轻轻加入孔中，每孔约100 μl。
4. 在培养箱中孵育15到30 min后拍照。
   
   

六、Opera高内涵成像

1. 打开Opera phenix仪器，打开电脑以及Harmony软件。
2. 将96孔板底部用擦镜纸擦干净后置于Opera phenix检测舱内。
3. 提前设置仪器检测环境参数37 °C，3% CO2，达到设定条件后再开始检测。
4. 选择10x物镜进行成像，软件内选择Alexa 488绿色荧光通道和Hoechst 33342蓝色荧光通道，并将聚焦高度设置为2 μm，曝光时间为100 min。每孔选择21个视野进行成像和统计。
5. 根据拍照效果对聚焦高度和曝光时间调整后进行拍照并保存。
   

结果与分析

1. 使用Harmony软件进行高内涵成像分析
   
   1.1

   选择实验的input images：
   本方案中选择Alexa 488绿色荧光通道和Hoechst 33342蓝色荧光通道的成像结果。
   
   1.2

   Find nuclei:
   使用Hoechst 33342通道成像结果对细胞核区域“nuclei”进行定义和选择。DNA甲基化抑制剂decitabine对细胞的生长和形态均有影响，并且细胞生长4 d后细胞间隙会变小。根据“nuclei”定义的效率以及准确性，选择最合适的分析“method”，如本方案中可选择“method C”。示意图见图1。
   
   
   图1. 定义细胞核 (左图对照组，右图阳性化合物decitabine)
   
   
   1.3

   Find image region:
   使用Alexa 488绿色荧光通道的图像定义“GFP region”用于后续抑制剂活性的统计分析。通过设定荧光强度和区域面积的阈值，尽可能排除假阳性region干扰。由于报告细胞生长4 d后细胞间隙会变小，“GFP region”以单个细胞为单位的计算准确性低，因此将相对聚集的细胞群体定义为“GFP region”的单位进行定量。报告细胞系中偶有细胞表达较弱的荧光蛋白背景信号，可选择在处理化合物之前通过流式细胞分选去除这些细胞，即可有效降低背景EGFP信号。定义“GFP region”示意图见图2，左图对照组中的实际荧光强度并不高，展示的是经过Harmony软件增强处理后的图像以方便定义和展示“GFP region”，后续定量计算采用绝对荧光强度因而不影响最终结果。图中颜色为软件根据荧光信号强度进行拟合之后，展示的“伪彩”。
   
   
   图2. 定义GFP region (左图对照组，右图阳性化合物decitabine)
   
   
   1.4

   数据分析与输出：
   在Harmony软件中按以上设定的参数，分析并输出：每孔中所有“GFP region”的荧光信号总强度，以及nuclei总数。
           计算均值“EGFP intensities per cell”：即将每孔“GFP region”的荧光信号总强度除以nuclei总数。该指标用于衡量DNA甲基化抑制剂在细胞中的活性，可以同时反映抑制剂激活EGFP表达的细胞比例以及激活程度。
   1.5

   GraphPad软件分析：
   在GraphPad软件中，使用“EGFP intensities per cell”及其对应的化合物浓度做图，并使用非线性回归拟合模型“[Agonist] vs. response -- Variable slope (four parameters) ”对曲线进行拟合，计算化合物的EC50 (Half maximal effective concentration) 以评估其去甲基化效果。
           阳性化合物的response曲线分析示意图见图3：EC50 = 1.88 μM；非线性回归拟合分析的R2 = 0.99表明曲线拟合较好。
   
   
   图3. DNA甲基化抑制剂的response曲线 (横坐标浓度单位为μM)

溶液配方

1. DMEM培养基：将以下试剂按比例混匀使用，89%的DMEM，10%的BI FBS以及1%的 penicillin-streptomycin溶液，保存于4 °C冰箱，并于两个月内使用。
2. PDL溶液：使用DPBS溶液将Poly-D-Lysine稀释至0.1 mg/ml使用，可保存于4 °C冰箱，并于两个月内使用。
3. Hoechst 33342工作溶液：使用DPBS溶液将Hoechst 33342稀释至终浓度5 μg/ml。现配现用。

致谢

感谢中国科学院生物物理研究所蛋白质科学研究平台的设备支持和王娅老师的技术帮助，以及导师朱冰的指导。该研究项目由以下基金资助：国家自然科学基金青年科学基金 (项目编号32000417) 和中国博士后科学基金第67批面上资助 (项目编号2020M670487)。本实验方案所使用报告细胞系B2-17此前已在本实验室发表的文章中使用：Li et al., (2018).

参考文献

1. Li, X., Shang, E., Dong, Q., Li, Y., Zhang, J., Xu, S., Zhao, Z., Shao, W., Lv, C., Zheng, Y., Wang, H., Lei, X., Zhu, B. and Zhang, Z. (2018). Small molecules capable of activating DNA methylation-repressed genes targeted by the p38 mitogen-activated protein kinase pathway. J Biol Chem 293: 7423-7436.