Establishment of a High-throughput Screening Platform for Small Molecule Inhibitors of Bcl-XL

研究背景

抑制Bcl-xl蛋白来释放细胞凋亡压力的方法是一种有吸引力的治疗癌症的策略。 在此之前的报道中，有关于Bcl-xl蛋白的药物设计。在2002年，Hamilton课题组就以荧光偏振实验结果为评价标准，来理性设计Bcl-xl蛋白的小分子抑制剂。数年来，对Bcl-2家族蛋白小分子抑制剂的开发一直是科研界的研究重点，而结合高通量筛选的技术手段，使发现更好更优的先导化合物成为可能。艾伯维公司相继研发了Bcl-2，Bcl-xl，Bcl-w的共抑制剂ABT-737，以及Bcl-2特异性抑制剂ABT-199，并在2016年ABT-199获得FDA批准治疗与17-p缺失相关的慢性淋巴细胞白血病(CLL)。这显示出了Bcl-2家族蛋白抑制剂开发的巨大潜力。目前关于Bcl-xl蛋白抑制剂设计的主要问题是缺少特异性靶向Bcl-xl的小分子化合物。所以，建立高通量的Bcl-xl小分子抑制剂筛选体系，有利于助力Bcl-xl特异性小分子抑制剂的发现和设计，并通过靶向Bcl-xl蛋白，来实现癌症治疗的突破。

材料与试剂

1. Bcl-xl 重组蛋白 (Proteintech, catalog number: Ag1232)
2. 5-FITC-(Acp)-GQVGRQLAIIGDDINR-NH2 荧光多肽 (苏州强耀生物订制)
3. 384孔黑聚苯乙烯微孔板 (Corning, catalog number: 4514)
4. PBS磷酸盐缓冲液 pH 7.4 (1x) (Gibco, catalog number: C10010500BT)
5. 1.5 ml棕色不透光离心管 (Axygen, catalog number: MCT-150-X)
   

仪器设备

1. 多功能酶标仪 (Perkin Elmer, model: EnVision)
2. 微量离心机 (Thermo Scientific, model: Legend Micro 17R)
   

实验步骤

在生物体内Bak蛋白可以自发形成α螺旋并且通过其蛋白上的BH3域很好地和同源家族蛋白Bcl-xl的结合，并且显示出了比较强的结合能力。我们以此为前提，通过设计并购买了带有荧光基团的荧光多肽和Bcl-xl蛋白质来完成体外实验。此次荧光多肽选取了Bak蛋白BH3域的16个氨基酸序列，并且添加了FITC基团作为荧光基团，在荧光基团和多肽序列之间添加烷基间隔器分子Acp（6-氨基己酸）。
实验原理如图1，荧光偏振 (Fluorescent Polarization Assay) 技术的测量基础是分子微观状态下的旋转能力，被广泛应用于溶液中分子相互作用的研究。该方法可用于测量两个分子之间的结合和离解。当一个自由状态的小荧光分子在溶液中被平面偏振光激发后，激发态分子快速旋转，导致光在很大程度上去极化。然而，如果荧光分子结合到更大的蛋白质上，旋转作用减弱，极化发射信号增强，并与蛋白结合分数成比例增加，并可以被荧光检测器检测到。


图 1. 实验原理

1. 将50 μg的Bcl-xl 重组蛋白粉末在4 °C预约离心，12,000 x g离心10分钟，目的是将粉末离心到离心管的底部。离心结束后加入4 °C预冷的PBS磷酸盐缓冲液，将蛋白震荡，溶解为14 μM的溶液，分装到小的离心管中，放到-80 °C的冰箱中备用。
2. 取1 mg订制的荧光多肽4 °C预约离心，12,000 x g离心5分钟。离心结束后加入4 °C预冷的PBS磷酸盐缓冲液，震荡溶解后稀释为3 μM的多肽溶液，分装到1.5 ml棕色不透光离心管中，放到-80 °C的冰箱中备用。
3. 取3 μM的荧光多肽储液，用4 °C预冷的PBS磷酸盐缓冲液稀释300倍放入不透光离心管中来配置荧光多肽的工作溶液 (Working buffer, WB) ，浓度为10 nM，取0.5 ml工作溶液备用。
   
4. 将稀释后的荧光多肽工作溶液按照图2的说明加入到编好序号的不透光离心管中，编号为1的不透光离心管加入100 μl的工作溶液，编号2-8的不透光离心管中分别放入50 μl的工作溶液。操作全程需谨慎避光，离心管放在冰上或者4 °C条件下完成。
   
   
   图 2. 离心管编号示意图
   
   
5. 首先在第一个不透光离心管中稀释溶解bcl-xl蛋白，将事先配置好的bcl-xl蛋白储液在第一个不透光离心管中稀释为1.4 μM的浓度，移液枪吹打混匀。然后按照二倍稀释法 (见图3)，取第一个离心管中的半倍体积的溶液放在第二个不透光离心管中，移液枪吹打混匀，这里对溶液混匀有助于蛋白浓度稀释的准确性。依次进行半倍稀释，最后将第七个离心管中的半倍体积储液混匀后吸弃，留存最后一管荧光多肽溶液不与bcl-xl混合，作为参照溶液。
   
   
   图 3. 二倍稀释法示意图
   
   
6. 在将实验体系配制好了以后，将不透光离心管放到室温静置孵育2个小时，目的是将混合好的bcl-xl和bak多肽充分作用。静置孵育期间注意避光，避免过分的震荡和干扰。
7. 在实验体系孵育完成后，将不透光离心管中的混合液转移到Corning 384孔板中，每孔体系为15 μl，每个浓度设三个平行对照板孔（图4）。
   
   
   图4. 孔板转移示意图
   
   
8. 在Perkin Elmer的多功能酶标仪EnVision上面进行参数设置。将Corning 384孔板放在酶标仪中。利用EnVision Workstation选择荧光偏振测量方法。设置相关参数，如微孔板的型号，荧光团的类型和激发和发射波长 (表格1)。然后，选择任意孔来优化测量的高度 (measurement height)，选择只有荧光多肽的孔来优化G值(G-factor)。
9. 在Perkin Elmer的多功能酶标仪EnVision上面进行荧光偏振数值检测，使用EnVision Workstation进行数据处理，具体参数设置请参照表格1。
   
   表 1. 仪器设置参数表
   
   
   

结果与分析

按照表格2中的浓度进行梯度测试，得到了图5的实验结果。

表 2. 梯度实验浓度表



图 5. 浓度梯度测试实验结果

分析：我们得到数据后进行了初步的分析，实验结果证明，在bcl-xl与bak荧光多肽结合后，荧光偏振的数值可以达到220 mp，并且与bcl-xl与荧光多肽不结合状态的68 mp有明显的差距。有效区间足够大，可以应用于检验小分子打断蛋白-多肽相互作用的效果。通过计算得到，该模型kd值在97.78 nM，和文献所报道的数据接近 (Kutzki et al., 2002)，具备可信度。

注意事项

关于参数设置：

1. 参数定义：Measurement height，指的是测量高度，该参数帮助确定仪器的最佳焦点位置。G-factor，用于校正滤光片、偏振器和单色器等光学元件，来帮助检测器确定最佳增益，该参数用于计算荧光偏振强度 (图6)，其中I_‖和I_⊥分别表示平行于入射光和垂直于入射光的发射光光强。将两处标红图片改成公式
   
   
   图 6. 偏振公式
   
   

关于溶液配方：

1. 此次实验所用溶液为PBS磷酸盐缓冲液，为商业化生物溶液，储存温度为室温。
2. 实验所配制蛋白储液，荧光多肽储液，荧光多肽工作溶液，需储存在-80 °C冰箱中，并且实验最好在1个月内使用。
   

致谢

感谢国家自然科学基金委面上基金 (项目编号21977061) 和科技部项目（项目编号 2021YFE0109300）提供的经费支持。感谢清华大学尹航教授课题组提供的支持。感谢清华大学药学技术中心活性筛选平台 (High Throughput Screening Core Facility，Center of Pharmaceutical Technology，Tsinghua University) 提供的仪器支持。感谢清华大学药学技术中心王婷老师和商世瑛老师的帮助和建议。

参考文献

1. Kutzki, O., Park, H. S., Ernst, J. T., Orner, B. P., Yin, H. and Hamilton, A. D. (2002). Development of a potent Bcl-x(L) antagonist based on alpha-helix mimicry. J Am Chem Soc 124(40): 11838-11839.
2. Khan, S., Zhang, X., Lv, D., Zhang, Q., He, Y., Zhang, P., Liu, X., Thummuri, D., Yuan, Y., Wiegand, J. S., et al. (2019). A selective BCL-XL PROTAC degrader achieves safe and potent antitumor activity. Nat Med 25(12): 1938-1947.