Genome-wide siRNA Screen for Transcription Regulators of Long Noncoding RNA NEAT1

研究背景

由NEAT1组装形成的paraspeckle富含复杂的蛋白质和RNA成分，因此NEAT1表达水平对于这些内含物的储存和转运影响了多种细胞生物学过程。如NEAT1协调增强由pre-RNAs内含子产生的pri-miRNA的加工(Jiang et al., 2017)；调控一类3’-UTR含有反向重复序列RNA的出核过程 (Chen and Carmichael, 2009)；NEAT1表达水平与paraspeckles的动态变化影响细胞分化、疾病进展和部分应激反应高度相关(Hirose et al., 2014; Imamura et al., 2014; Adriaens et al., 2016;Wang et al., 2018)。尽管NEAT1/paraspeckle的重要功能被陆续报道，然而NEAT1自身是如何被调控的相关研究仍相对滞后。
对于基因转录调控的筛选目前普遍使用全基因组RNAi文库或CRISPR/Cas9文库。传统的外源性的小干扰RNA (small interference RNAs, siRNAs) 对于敲减目的基因的表达是非常有效的，全基因组siRNA文库可允许研究人员通过高通量的方式研究每个基因对特定细胞表型的影响。相比之下CRISPR/Cas9筛选过程中细胞单一性较强，文库自身的可操作性更高，使用过程也更为便捷。对于NEAT1转录调控的筛选，我们在NEAT1内源启动子后插入EGFP基因，构建了用荧光强度指示NEAT1表达水平的可视化系统。由于NEAT1自身的表达水平具有一定的周期性 (Torres et al., 2016)，因此对NEAT1表达水平的监控和评估采以细胞群体为基础更为合理。所以这里我们采用RNAi文库筛选的方式对NEAT1进行转录调控的筛选。在筛选过程中，部分蛋白的敲降可能会影响细胞整体转录水平的改变或产生细胞毒性，为了避免这些蛋白产生的非特异性结果，我们利用慢病毒感染的方式在待筛选细胞中整合了由外源启动子EF1α驱动表达的mCherry作为荧光筛选的内参。最终NEAT1表达水平的改变由EGFP，mCherry以及EGFP/mCherry三个参数进行确定。

材料与试剂

1. HeLa细胞 (ATCC, catalog number: CCL-2)
2. HEK293细胞 (ATCC, catalog number: CRL-1573)
3. DMEM (Gibco^TM, catalog number: 11965092)
4. Fetal bovine serum (FBS) (Gibco^TM, catalog number: 10270-106)
5. 0.25% Trypsin (Gibco^TM, catalog number: 27250018)
6. Penicillin streptomycin (Hyclone, catalog number: SV30010)
7. Opti-MEM^® I Reduced Serum Medium (Gibco^TM, catalog number: 31985070)
8. Lipofectamine^TM 3000 Reagent (Thermo, catalog number: 21341)
9. Lipofectamine^TM RNAiMAX Transfection Reagent (Thermo, catalog number: 13778030)
10. Human ON-TARGETplus siRNA library –Genome- SMARTpool (Dharmacon)
11. MISSION^® esiRNA (Sigma, catalog number: EHUEGFP)
12. Transcription activator-like effector nuclease (TALEN) (Addgene, catalog number: #1000000034)
13. psPAX2 (Addgene, catalog number: #12260)
14. pMD2.G (Addgene, catalog number: #12259)
15. 84消毒液
16. Phosphate buffered saline (PBS) 缓冲液 (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 高内涵细胞成像分析仪Operetta (PerkinElmer，Operetta高内涵细胞分析系统)
2. 自动化洗板机ELx405 (BioTek，ELx405 Select Deep Well Microplate Washer)
3. 自动化分液仪 Multidrop Combi (Thermo Fisher，Multidrop Combi自动化分液仪)
4. CO₂培养箱 (Thermo Fisher，Heracell 150i)
5. 水平离心机 (Beckman Coulter, model: Allegra X-12R)
   

实验步骤

一、构建筛选用细胞系NEAT1^G-HeLa-R (图1)


图 1. NEAT1^G-HeLa-R 细胞系构建流程。

1. 构建靶向基因组5'-GACCCCGGTGACGCG-3' 和 5'-AGTTGTGGCAAGTCC-3'序列的TALEN-NEAT1质粒 (具体操作方法请见(Cermak et al., 2011))
2. 构建用于在NEAT1转录起始位点前插入EGFP报告基因的供体质粒NEAT1-GFP，其中同源臂序列分别为chr11:65,421,968-65,422,789和chr11:65,422,798-65,423,623，从HeLa基因组DNA扩增获得；报告基因EGFP-poly(A) 序列则是从pEGFP-C1质粒扩增获得。
3. 使用Lipofectamine 3000 Reagent转染TALEN-NEAT1和NEAT1-GFP质粒。
   
   3.1

   转染前24 h于3.5 cm培养皿中预铺30%汇合度的HeLa细胞；
   3.2

   用50 μL Opti-MEM稀释3μL Lipofectamine 3000并混匀；用50 μL Opti-MEM稀释 3μL P3000, 0.5 μg TALEN-NEAT1和1 μg NEAT1-GFP并混匀；
   3.3

   将稀释的质粒加入稀释的Lipofectamine 3000中，混匀并室温静置15 min；
   3.4

   将质粒-脂质体复合物逐滴、均匀地加入到细胞中；
   3.5

   8 - 2 h后更换新的DMEM完全培养基。
4. 转染48 h后，用1 μg/mL puromycin 筛选细胞3天。
5. 筛选后的细胞以单克隆形式培养，后续挑选带有合适绿色荧光的细胞系进行基因型鉴定获得NEAT1G-HeLa。
6. 包装pHAGE-EF1⍺-IRES-mCherry病毒。
   
   6.1

   转染前24 h于3.5 cm培养皿中预铺30%汇合度的HEK293细胞；
   6.2

   用50 μL Opti-MEM稀释4 μL Lipofectamine 3000并混匀；用50 μL Opti-MEM稀释 4 μL P3000, 1 μg pHAGE-EF1⍺-IRES-mCherry，0.75 μg psPAX2和0.25 μg pMD2.G并混匀；
   6.3

   将稀释的质粒加入稀释的Lipofectamine 3000中，混匀并室温静置15 min；
   6.4

   将质粒-脂质体复合物逐滴、均匀地加入到细胞中；
   6.5

   6 h后更换新的DMEM完全培养基;
   6.6

   分别于24 h、48 h收集两次病毒上清液，病毒液经混匀后1,000 × g离心5 min，上清液经0.45 μm滤膜过滤后分装。
7. 在NEAT1^G-HeLa传代过程中，按体积比1:1混合DMEM完全培养基和病毒液，悬浮感染细胞。
8. 将感染后的细胞以单克隆形式培养，后续挑选带有合适绿色、红色荧光的细胞系NEAT1^G-HeLa-R。
   

二、全基因组siRNA文库筛选 (图2)


图 2. Human siGENOME SMARTpool siRNA library筛选NEAT1^G-HeLa-R 流程。

此文库参考筛选条件为RNAiMAX 0.1 μL/孔, 体系10 μL。对于转染条件的优化，我们这里仅作预铺细胞数目的优化。我们在384孔板中分别预铺100，200，500，1,000个待筛选细胞，并补加1x siRNA buffer稀释的scramble siRNA，10 μL经Opti-MEM按体积比1:100稀释的Lipofectamine^TM RNAiMax，培养72 h。通过观察细胞的汇合度，发现500个/孔的预铺条件最为理想，在72 h后达到80% ~ 90%左右。
经转染优化实验，确定最适转染条件为：在384孔板中，使用Lipofectamine^TM RNAiMAX 0.1μL/孔，转染体系10μL，细胞接种密度 500个/孔，转染72 h后进行表型检测。
siRNA转染的具体操作步骤如下：

1. 阴、阳性对照组的制备：
   
   1.1

   使用1x siRNA buffer 分别稀释scramble siRNA 及esiEGFP至0.1 μM；
   1.2

   在H2, I2, J2孔中加入10 μL esiEGFP稀释液 (0.1 μM)，设置为NEAT1-EGFP荧光信号减弱的阳性对照；在第二列其它孔中加入scramble siRNA (0.1 μM)，设置为对照组。
2. 转染试剂的制备：
   2.1

   用Opti-MEM按照体积比1:100稀释Lipofectamine^TM RNAiMax；
   2.2

   使用自动化分液仪 Multidrop Combi将上述转染试剂溶液加入siRNA板内 (第2列至第23列)，10 μL /孔；
   2.3

   水平离心机100 × g离心1 min，将siRNA与RNAiMax混匀；
   2.4

   室温静置20 min。
3. 细胞悬液的制备：
   3.1

   将NEAT1^G-HeLa-R细胞配制成浓度为500个细胞/30 μL DMEM完全培养基的悬液；
   3.2

   使用自动化分液仪 Multidrop Combi将上述细胞悬液加入siRNA板 (第2列至第23列)，30 μL /孔；
   3.3

   为减少边缘效应，在384孔板第1列及第24列加入50 μL PBS或 DMEM。
4. 将加好转染试剂和细胞的384板经水平离心机中100 × g离心2 min，放置于CO₂培养箱中培养72 h。

三、表型检测

1. 转染72 h后，使用PBS及自动洗板机ELx405清洗细胞3次 (抽吸30 μL 1x PBS并补充新的30 μL 1x PBS，重复3次)，最后将培养基置换为1x PBS；此步骤的目的是降低由培养基导致的成像背景信号值过高，从而提高图像信噪比。
2. 使用Operetta高内涵成像分析仪对清洗后的384板成像 (10倍长工作距离物镜，GFP和mCherry双通道)。
3. 利用Harmony软件进行图像定量分析，分别计算各孔GFP和mCherry的平均荧光强度。
   

结果与分析

用于NEAT1^G-HeLa-R筛选的384板经Operetta成像的结果代表图如图3所示 (红色荧光图未展示，第1、23、24列非实验组未展示)。第2列中H2-J2为esiEGFP处理组 (阳性对照组)，其它为Scramble组 (对照组)；第3列至第22列为siRNA处理组。成像数据经Operetta采集、自动化分析可得出量化的荧光数值，这些数据经过合理的分析 (图4) 得到初步的筛选结果，具体流程如下：


图 3. NEAT1^G-HeLa-R 筛选结果绿色荧光通道代表图及各孔信息。


图 4. 筛选结果的初步数据分析步骤及结果。

1. 利用Scramble组的GFP和RFP荧光值分别标准化各siRNA处理组的荧光值。
2. 上调的调控因子阈值设定为：GFP < 0.8 & mCherry > 0.8 & GFP/mCherry < 0.75。
3. 下调的调控因子阈值设定为：GFP > 1.2 & mCherry < 1.2 & GFP/mCherry > 0.75。
4. 合并两次重复筛选的结果，获得107个上调因子和215个下调因子的初步筛选结果。
5. 根据HeLa的RNA二代测序结果去除初步筛选结果中不表达的基因，获得63个上调因子和108个下调因子。
6. 后续进行复筛或其他方法进行验证。
   

溶液配方

1. 1x PBS，配置后调整pH值为7.2 ~ 7.4并过滤灭菌
   NaCl 8 g
   Na₂HPO₄ 2.9 g
   KCl 0.2 g
   KH₂PO₄ 0.2 g
   ddH₂O补至1 L
   

致谢

感谢中科院生化与细胞所化学生物学平台对本实验方法的帮助和技术支持。本实验方法得到中国科技部 (2016YFA0100701)、中国科学院 (XDB19020104)、国家自然科学基金 (31725009、31730111、91440202) 和霍华德·休斯医学研究所 (55008728) 的支持。此方法已被使用，相应研究成果被发表在Nature Cell Biology (Wang et al., 2018)。

参考文献

1. Adriaens, C., Standaert, L., Barra, J., Latil, M., Verfaillie, A., Kalev, P., Boeckx, B., Wijnhoven, P. W., Radaelli, E., Vermi, W. et al. (2016). p53 induces formation of NEAT1 lncRNA-containing paraspeckles that modulate replication stress response and chemosensitivity. Nat Med 22(8): 861-868.
2. Chen, L. L. and Carmichael, G. G. (2009). Altered nuclear retention of mRNAs containing inverted repeats in human embryonic stem cells: functional role of a nuclear noncoding RNA. Mol Cell 35(4): 467-478.
3. Cermak, T., Doyle, E. L., Christian, M., Wang, L., Zhang, Y., Schmidt, C., Baller, J. A., Somia, N. V., Bogdanove, A. J. and Voytas, D. F. (2011). Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting. Nucleic Acids Res 39(12): e82.
4. Imamura, K., Imamachi, N., Akizuki, G., Kumakura, M., Kawaguchi, A., Nagata, K., Kato, A., Kawaguchi, Y., Sato, H., Yoneda, M., et al. (2014). Long noncoding RNA NEAT1-dependent SFPQ relocation from promoter region to paraspeckle mediates IL8 expression upon immune stimuli. Mol Cell 53(3): 393-406.
5. Jiang, L., Shao, C., Wu, Q.J., Chen, G., Zhou, J., Yang, B., Li, H., Gou, L.T., Zhang, Y., Wang, Y., et al. (2017). NEAT1 scaffolds RNA-binding proteins and the Microprocessor to globally enhance pri-miRNA processing. Nat Struct Mol Biol 24(10): 816-824.
6. Torres, M., Becquet, D., Blanchard, M.P., Guillen, S., Boyer, B., Moreno, M., Franc, J.L., and Francois-Bellan, A.M. (2016). Circadian RNA expression elicited by 3'-UTR IRAlu-paraspeckle associated elements. Elife 5.
7. Wang, Y., Hu, S. B., Wang, M. R., Yao, R. W., Wu, D., Yang, L. and Chen, L. L. (2018). Genome-wide screening of NEAT1 regulators reveals cross-regulation between paraspeckles and mitochondria. Nat Cell Biol 20(10): 1145-1158.