Investigation of Cellular PAR Using High-Content Imaging System

材料与试剂

1. 96孔培养板 (Greiner Bio-One, catalog number: 655090)
2. Fetal Bovine Serum胎牛血清 (Gibco, catalog number: 10100147)
3. 一抗pADPr (10H) (Santa Cruz, catalog number: sc-56198)
4. 二抗Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 (Invitrogene, catalog number: A32723)
5. DAPI (碧云天, catalog number: C1002)
6. DMEM培养基 (Gibco, catalog number: 11995065)
7. PBS (上海源培生物科技有限公司, catalog number: B310KJ)
   
8. 木犀草素 (美仑生物, catalog number: MB2172)
9. olaparib (美仑生物, catalog number: MB1700)
   

仪器设备

1. 哺乳动物细胞二氧化碳恒温培养箱 (Thermo Fisher Scientific, HERACELL 150i)
2. ELISA平板洗板机 (Biotek)
3. 高内涵成像系统 (Perkin Elmer)
   

实验步骤

我们以来源于胰腺癌的BRCA缺陷型细胞Capan-1为例进行研究。强氧化剂 (过氧化 氢) 处理细胞后，会引起DNA损伤，产生断裂。处理后的细胞依次与抗PAR抗体、 荧光二抗孵育，检测不同浓度小分子抑制剂作用下，Capan-1细胞平均荧光强度的变 化情况。本次实验使用阳性小分子奥拉帕尼 (Olaparib) 与待检测的小分子木犀草素 (Luteolin) 进行检测。具体实验步骤如下：

一、实验操作部分

1. 第1天
   将处于对数生长期的Capan-1细胞以90 μl, 20,000个/孔接种于96孔培养板， 37 °C，5% CO₂静置培养过夜。
   
2. 第2天
   2.1

   每孔加入10 μl不同浓度的小分子药物，每个浓度至少设三个重复。放置于培 养箱中继续培养4 h (使用前先将阳性小分子Olaparib与待检测的小分子木犀 草素溶解于DMSO，配置成浓度为10 mM的母液；根据小分子浓度梯度，加 样前用含10% DMSO的PBS溶液配置10倍工作浓度的小分子溶液，依次加 到对应的孔中，每个孔DMSO终浓度为1%)。
   2.2

   每孔加入2 μl过氧化氢 (终浓度为200 μM)，设置加与不加过氧化氢的对照； 细胞在培养箱中继续培养5 min。
   2.3

   弃去上清，每孔加入100 μl预冷甲醇，4 °C固定20 min。孵育结束后PBS 洗6遍，每孔300 μl。
   2.4

   加入一抗pADPr (10H) (稀释比例为1:200)，用含1 mg/ml BSA及0.05% Tween-20的PBS (B-PBST) 稀释，室温震荡孵育1 h。之后B-PBST清洗 3遍。
   2.5

   加入Alexa Fluro 488耦连的抗鼠IgG二抗，稀释比例为1:200，室温震荡孵 育20 min。
   2.6

   按照稀释比列为1:2,000加入1 mg/ml的核染料DAPI，室温下避光静止15 min。B-PBST洗6遍。
   2.7

   孵育结束后，加入100 μl B-PBST，使用高内涵成像系统 (Operetta High-Content Imaging System) 进行检测。抑制率% = (I _max - I _treated) / (I _max - I _blank) × 100%。
   I为高内涵成像系统给出的平均荧光强度 (Luminescence)。I _blank为未加入过氧化氢处理，加入1% DMSO处理的细胞的平均荧光强度。I _max为加入过氧化氢处理，加入1% DMSO处理的细胞的平均荧光强度。I _treated为实验组平均荧光强度。统计每个孔的平均荧光强度，利用Graphpad软件统计绘制，计算对应的IC₅₀值 (见图2)。

二、高内涵成像系统操作部分

1. 将上述实验板用擦镜纸分别将孔板底部擦拭干净后放入PE高内涵成像仪Operetta中进行成像。
2. 使用10x长工作距离物镜，打开Harmony软件，添加A488绿色 (Ex460-490/Em500-550)，DAPI蓝色 (Ex360-400/Em410-480) 成像通道，选择空白细 胞孔 (未加过氧化氢处理，未加小分子)、阳性对照孔 (加过氧化氢处理，未加小 分子) 进行预扫后确定成像条件：曝光时间，聚焦高度，激发光强度。确定条件 后每孔选择6视野进行拍摄。
3. 成像后利用Columbus 软件进行分析计算。计算流程及说明见表1及图1。
   
   
   图1. Columbus 软件高内涵分析界面
   
   表1. Columbus软件高内涵分析流程及说明
   
   
   

结果与分析

如图2，高内涵检测结果：蓝色为使用DAPI染色的细胞核，绿色为使用荧光抗体孵育 染色后的PAR染色结果。olaparib与木犀草素抑制曲线，纵坐标为根据归一化之后每 个孔样品平均FITC荧光强度计算的抑制率。细胞内PAR的形成与木犀草素与阳性对照奥拉帕尼都具有一定的剂量依赖效果。两种小分子对细胞内PAR形成抑制的IC₅₀分别约为25.4 μM与2.5 nM。


图2. 高内涵成像结果与半数抑制浓度IC₅₀计算

致谢

感谢免疫化学研究所高通量平台对于高内涵成像的技术支持。该研究受到了国家自然科学基金 (21977070, 31500632，U19A2011) 资助。本实验已发表于文章Li et al. (2020)。该实验方案也参考了Yuan et al. (2017) 文章。

参考文献

1. Brenner, S. and Lerner, R. A. (1992). Encoded combinatorial chemistry. Proc Natl Acad Sci U S A 89(12): 5381-5383.
2. Li, J., Li, Y., Lu, F., Liu, L., Ji, Q., Song, K., Yin, Q., Lerner, R. A., Yang, G., Xu, H. and Ma, P. (2020). A DNA-encoded library for the identification of natural product binders that modulate poly (ADP-ribose) polymerase 1, a validated anti-cancer target. Biochem Bioph Res Co 533(2): 241-248.
3. Ma, P., Xu, H., Li, J., Lu, F., Ma, F., Wang, S., Xiong, H., Wang, W., Buratto, D., Zonta, F., Wang, N., Liu, K., Hua, T., Liu, Z. J., Yang, G. and Lerner, R. A. (2019). Functionality‐Independent DNA Encoding of Complex Natural Products. Angew Chem Int Edit 131(27): 9355-9362.
4. Yuan, B., Ye, N., Song, S. S., Wang, Y. T., Song, Z., Chen, H. D., Chen, C. H., Huan, X. J., Wang, Y. Q., Su, Y., Shen, Y. Y., Sun, Y. M., Yang, X. Y., Chen, Y., Guo, S. Y., Gan, Y., Gao, Z. W., Chen, X. Y., Ding, J., He, J. X., Zhang, A. and Miao, Z. H. (2017). Poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) inhibition and anticancer activity of simmiparib, a new inhibitor undergoing clinical trials. Cancer Lett 386: 47-56.