Screening of Negative Regulators of Hippo Pathway in Gastric Cancer Cells with Nuclear Translocation of YAP as Readout

材料与试剂

1. 15 ml离心管 (Corning, catalog number: CLS430791)
2. 50 ml离心管 (Corning, catalog number: CLS430828)
3. 10 ml移液管 (Corning, catalog number: 4488)
4. 1.5 ml离心管 (Axygen, catalog number: MCT-150-C)
5. 96孔圆底板 (Corning, catalog number: CLS3879)
6. 384孔Viewplate黑色透明底板 (Perkin Elmer, catalog number: 6007460)
7. RPMI 1640 (Thermo, catalog number: 11875093)
8. Opti-MEM (Thermo, catalog number: 31985088)
9. FBS (Biological Industries, catalog number: 04-001-1A)
10. Trypsin-EDTA (0.25%) (Thermo, catalog number: 25200072)
11. Penicillin/streptomycin (Thermo, catalog number: 15070063)
12. Lipofectamine RNAiMAX reagent (Thermo, catalog number: 13778075)
13. PFA (Sigma-Aldrich, catalog number: 158127)
14. Triton X-100 (Sigma-Aldrich, catalog number: 93443)
15. BSA (生工生物工程(上海)股份有限公司，catalog number: 9048-46-8)
16. DharmaFECT1 (Horizon，catalog number: T-2001-03)
17. TOX (Thermo, catalog number: AM16708)
    
    

抗体

1. YAP (63.7) antibody (Santa Cruz, catalog number: sc-1001199)
2. Alexa Fluor 488 Goat anti-Mouse secondary antibody (Thermo, catalog number: A32723)
3. DAPI (Sigma-Aldrich, catalog number: 28718-90-3)
   
   

细胞系
HGC-27细胞 (上海生命科学研究院细胞资源中心，TCHu 22)

仪器设备

1. 离心式自动洗板机 (BlueCatBio，model: BlueWasher)
2. Multidrop自动分液器 (Thermo Fisher，model: Multidrop Combi)
3. Opera激光共聚焦高内涵细胞成像分析系统 (Perkin Elmer，model: Opera LX488/561/640)
4. Operetta高通量细胞成像分析系统 (Perkin Elmer，model: Operetta)
5. 隔水式恒温培养箱 (上海精宏实验设备有限公司)
6. 水平冷冻离心机 (Eppendorf，model: 5810R)
7. 细胞计数仪 (Invitrogen，model: Countess)
8. 二氧化碳恒温细胞培养箱 (Thermo Fisher，model: Thermo Series 8000)
9. 电动移液器 (Eppendorf)
10. Ensight多功能微孔板检测仪 (Perkin Elmer，model: Ensight)
11. Bravo自动化液体处理平台 (Agilent，model: Bravo)
    

实验步骤

一、预实验：
在本实验中，我们选择胃癌细胞系HGC-27作为实验对象，进行最佳细胞密度、转染试剂类型及转染试剂浓度的测试 (图1)。由于Hippo信号通路受细胞密度的影响，细胞密度低的情况下，Hippo信号通路被抑制，YAP入核；细胞密度高的情况下，YAP在细胞质中 (Zhao et al., 2007; Ota and Sasaki, 2008)。因此，我们选择在低细胞密度的情况下进行筛选Hippo通路的负调控因子。

1. 测试条件：
   细胞密度梯度：每孔250、500、750、1,000个细胞。
   转染试剂：RNAiMAX和DharmaFECT1。
   转染试剂浓度：每孔0.05、0.1和0.15 μl。
   NC：negative control siRNA。
   TOX：用于检测转染效率。
   转染时间：48小时。
   
   
   图1. 384孔板测试条件分布
   
   
2. 实验步骤
   
   2.1

   首先在Viewplate 384孔板中加入siRNA，用opti-MEM稀释siRNA至终浓度为20 nM，每孔加入10 μl siRNA；384孔板每孔按照图1所示加入对应的转染试剂及剂量，用Opti-MEM补齐至10 μl。
   2.2

   加入10 μl siRNA和10 μl转染试剂后，800 rpm水平离心1分钟，室温静置混匀30分钟。
   2.3

   在siRNA和转染试剂静置过程中，准备细胞。HGC-27细胞经胰酶消化后用1640完全培养基重悬，随后进行细胞计数，每孔加入30 μl对应密度的细胞量。 (由于血清的终浓度为10%，用Opti-MEM配制siRNA和转染试剂中未加入血清，因此在1640完全培养基中的血清浓度为16.7%)。
   2.4

   每孔加入对应密度的细胞后，800 rpm水平离心1分钟，使细胞沉降在板底。随后将384孔板放置在含有5% CO₂的37 °C培养箱中培养48小时。
   2.5

   用Ensight多功能微孔板检测仪进行明场和绿色荧光拍照，明场中看细胞死亡情况确定转染试剂使用浓度。
   2.6

   随后运用免疫荧光检测不同细胞密度下YAP在核内的定位情况：
   首先在384孔板中每孔加入16 μl 16% PFA（PFA终浓度为4%），800 rpm水平离心1分钟，37 °C培养箱中固定15分钟。其次用离心式自动洗板机洗板，PBS洗3次，每次每孔加入50 μl PBS溶液，洗板完成后加入50 μl含有0.05% Triton X-100的PBS溶液室温静置10分钟，使细胞膜穿透。然后再用PBS洗3次，最后每孔加入15 μl 5% BSA配制的YAP（1:250）一抗进行4 °C过夜孵育。第二天用PBS洗去一抗，加入DAPI（1:1,000，1 mg/ml）和荧光二抗（1:1,000）室温共孵育1小时，PBS洗3次，最后每孔加入50 μl PBS后进行拍照。
   2.7

   确定合适的筛选条件：选择视野中细胞分散且YAP定位于核内的筛选条件，如图2所示。
   确定合适的筛选条件：
   细胞密度：每孔250个细胞；转染试剂：RNAiMAX；转染试剂浓度：384孔板 每孔0.05 μl。
   
   
   图2. YAP定位情况
   
   

二、高通量筛选：

1. 选择Human ON-TARGETplus (OTP) siRNA亚文库：GPCR、Phosphatase和Protease等亚文库。利用Bravo自动化液体处理平台进行亚文库整版分装，每块整版3个重复，每孔加入10 μl siRNA。
2. 用Multidrop自动分液器加样，每孔10 μl RNAiMAX液体 (0.05 μl RNAiMAX + 9.5 μl Opti-MEM)，800 rpm水平离心1分钟，室温静置混合15分钟后，加入30 μl HGC-27细胞 (250个/孔)，800 rpm水平离心1分钟使细胞沉降至板底，放入37 °C培养箱中培养48小时。
3. 免疫染色方法见上面实验步骤第(6)步。
4. 使用Opera或者Operetta进行拍照，用Columbus软件进行荧光强度计算和统计。
   
   4.1

   将数据导入至Columbus中 (图3)。
   
   
   图3. 数据导入
   
   
   4.2

   上传数据后，点击数据处理和分析按钮进行荧光数据定量分析(图4)。
   
   
   图4. 数据处理和分析
   
   
   4.3

   进入数据分析界面 (图5)，界面左侧为数据处理流程，可按照需求自定义；界面中间为所拍摄的荧光图片预览界面；界面右侧为荧光强度、颜色等调整界面。
   4.4

   分析流程：
   定义细胞核区域 (图6)→定义细胞质区域 (图7)→计算细胞核roundness，排除细胞核形态异常的细胞 (图8)→选择计算细胞核荧光强度的区域进行细胞核荧光强度计算 (图8)→选择计算细胞质荧光强度的区域进行细胞质荧光强度计算 (图8)→定义细胞质荧光强度/细胞核荧光强度＞1.25的为YAP定位在细胞质，定义细胞质荧光强度/细胞核荧光强度≤1的为YAP定位在细胞核 (图9)→批量处理数据并输出分析结果。
   
   
   图5. 数据分析预览界面
   
   
   图6. 利用DAPI定义细胞核
   
   
   图7. 定义细胞质区域
   
   
   图8. 计算细胞核和细胞质的荧光强度
   
   
   图9. 计算YAP在细胞核和在细胞质中的具体数目
   
   
   图10. 根据需求导出数据
   
   

结果与分析

       本实验根据YAP在细胞质和细胞核内的荧光强度比值进行分类，定义细胞质荧光强度/细胞核荧光强度＞1.25的为YAP定位在细胞质，定义细胞质荧光强度/细胞核荧光强度≤1的为YAP定位在细胞核 (比例数值大小根据实验具体荧光强度可稍做调整)。随后计算加入siNC和不同siRNA后YAP在细胞质中的细胞数目/总细胞数 (cyto ratio)，用siRNA (cyto ratio) – siNC (cyto ratio) 即为加入不同siRNA后的YAP入核抑制率。以亚文库Phosphatase筛选为例，利用GraphPad Prism 8.0软件进行图像处理，将处理后所得数据导入软件XY Table中作图，横坐标为基因数目，纵坐标为YAP入核抑制率，得到YAP入核抑制率≥30%以上的基因数6个，即这6个基因敲低后能够促进YAP的出核 (图11)。


图11. 亚文库Phosphatase中各个基因敲低导致YAP入核的抑制率大小

失败经验

1. 细胞生长密度影响实验结果：
   
   1.1

   在实验过程中，由于细胞成簇生长，在未加入任何处理时，就已经导致YAP出核 (图12)。解决方案一：消化细胞时，将EDTA的浓度由原来的0.25%提高至0.5%，减少细胞之间的连接；解决方案二：转染时间缩短为48小时，减小细胞成簇的现象。
   1.2

   前期细胞培养时，如果一直是高密度培养，即使在筛选时每孔只加入250个细胞 (细胞密度低)，但由于之前培养时高密度导致YAP在细胞质，短时间内降低密度是不会引起YAP在细胞核。因此，在筛选前的细胞培养过程中，一直需要保持细胞密度低的情况，使得YAP在细胞核内，筛选过程中铺细胞后才不会影响实验结果。
   
   
   图12. 细胞成簇生长导致YAP出核
   
   
2. 处理结果无法得到正确的YAP在细胞质和细胞核的数目
   解决方案一：调整YAP在细胞质和细胞核的荧光强度的定义，修改计算荧光强度的范围；解决方案二：对比荧光图片预览区域，调整细胞质荧光强度/细胞核荧光强度的比值大小范围，得到正确的分群信息。
3. 实验过程中关键步骤的影响实验结果
   
   3.1

   FBS浓度改变会影响YAP的出入核状态，由于细胞生长过程中血清的终浓度为10%，用Opti-MEM配制siRNA和转染试剂时未加入血清，因此在1640完全培养基中的血清浓度提高至为16.7%，去除FBS对于YAP出入核的影响。
   3.2

   YAP抗体的选择，需要选择适合做免疫荧光的抗体，即可以检测YAP出入核的变化情况。

溶液配方

1. 1640完全细胞培养液
   16.7% FBS, penicillin/streptomycin (v/v: 1:100)加入到1640基础培养基中
   4 °C保存，使用前37 °C水浴加热。
2. PBS缓冲液
   8 g NaCl，0.2 g KCl，14.2 g Na₂HPO₄，0.27 g KH₂PO₄，加入800 ml双蒸水溶解，用HCl调pH值至7.4，加水定容至1 L
   0.22 μm滤膜过滤后，高压蒸汽灭菌，室温或4 °C保存。
3. 5% BSA
   5 g BSA用PBS缓冲液溶解并定容至100 ml，0.22 μm滤膜过滤，4 °C保存。
4. 0.05% Triton X-100
   50 μl Triton X-100用PBS缓冲液溶解并定容至100 ml
   0.22 μm滤膜过滤，4 °C保存。
5. YAP (63.7) 抗体稀释
   按1:250的稀释倍数，溶解至5% BSA中，4 °C保存。
6. Alexa Fluor 488 Goat anti-Mouse 二抗稀释
   按1:1,000的稀释倍数，溶解至5% BSA中，4 °C保存。
7. DAPI稀释
   按1:1,000的稀释倍数，溶解至5% BSA中，4 °C保存。
8. PBA溶液
   PBS缓冲液中加入0.5% BSA配制，4 °C保存。
   

致谢

感谢中国科学院分子细胞科学卓越中心化学生物学技术平台对本实验方法的帮助和改进。本实验得到国家自然科学基金项目 (81822035, 82002493) 和中国博士后科学基金项目（2020T130477）的资助。

参考文献

1. Ota, M. and Sasaki, H. (2008). Mammalian Tead proteins regulate cell proliferation and contact inhibition as transcriptional mediators of Hippo signaling. Development 135(24): 4059-4069.
2. Zhao, B., Wei, X., Li, W., Udan, R. S., Yang, Q., Kim, J., Xie, J., Ikenoue, T., Yu, J., Li, L., Zheng, P., Ye, K., Chinnaiyan, A., Halder, G., Lai, Z. C. and Guan, K. L. (2007). Inactivation of YAP oncoprotein by the Hippo pathway is involved in cell contact inhibition and tissue growth control. Genes Dev 21(21): 2747-2761.