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In-situ Hybridization for Mouse Brain Sections

应 应玥
蔡 蔡予琦
吴 吴锦云
何苗 何苗

Published: Aug 10, 2021 DOI: 10.21769/BioProtoc.1010818 Views: 5321

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摘要：原位杂交 (In-situ hybridization, ISH) 可对组织细胞中的RNA进行定性检测。原位杂交的基本原理为：带有标记物的核酸探针通过碱基互补配对特异性结合组织细胞中的待测RNA，形成杂交体。杂交体被抗体识别后，经过显色反应，可直接在组织切片上观察到待测RNA的表达情况。本篇实验指南以地高辛 (DIG) 标记的核酸探针为例，介绍原位杂交的基本操作步骤。

Keywords: 原位杂交 search 碱基互补配对 search 抗原抗体结合 search 显色反应 search

材料与试剂

  1. 去离子水 (Milipore)
  2. 经焦碳酸二乙酯 (DEPC) 处理的去离子水
  3. 4%多聚甲醛 (PFA)
  4. 经DEPC处理的磷酸盐缓冲溶液 (PBS) (pH 7.4-7.5)
  5. 20%, 30%蔗糖 (Invitrogen, catalog number: 15503-022) 溶液 (经DEPC处理的1× PBS配制)
  6. OCT包埋剂 (SAKURA, catalog number: 4583)
  7. 三羟甲基氨基甲烷 (Tris) (BBI, catalog number: A600194-0500)
  8. 盐酸 (HCl) (生工，catalog number: 10011018)
  9. 三乙胺醇 (TEA) (1M) (VETEC, catalog number: V900257)
  10. 蛋白酶K (ThermoFisher, catalog number: 25530-049)
  11. 抗地高辛碱性磷酸酶 (Anti-DIG-AP) (Roche, catalog number: 11093275910)
  12. RNA探针
  13. 100%甲醇 (沪试，catalog number: 10014118)
  14. 封片剂 (碧云天，catalog number: P0126)
  15. 柠檬酸钠缓冲液 (SSC) (pH 7.0)
  16. PK缓冲液 (见溶液配方)
  17. 杂交溶液 (见溶液配方)
  18. 缓冲液B1 (见溶液配方)
  19. 缓冲液B2 (见溶液配方)
  20. 缓冲液B3 (见溶液配方)
  21. 缓冲液B4 (遮光贮存) (见溶液配方)

仪器设备

  1. 冰冻切片机 (Leica, catalog number: CM1950) (图1A)
  2. 防卷板 (Leica, 14047742497)
  3. 量筒 (申玻)
  4. 杂交炉 (UVP，catalog number: HL-2000) (图1B)
  5. 桌面离心机 (Thermo Fisher，catalog number: 75002420) (图1C)
  6. 金属浴 (奥盛，catalog number: MK2000-2E) (图1D)
  7. 脱色摇床 (QILINBEIER，catalog number: TS-1) (图1E)
  8. 磁力搅拌器 (SCILOGEX，catalog number: MS7-H550-Pro)
  9. 水浴锅 (精宏，catalog number: DK-S24)
  10. 盖玻片 (Fisherbrand，catalog number: 12-544-E) (图2A) (或：Electron Microscopy Sciences，catalog number: 70329-60；或：LifterSlip，catalog number: 100499-626)
  11. 载玻片 (Fisherbrand，catalog number: 12-550-15) (图2B)
  12. 阻水笔 (ImmEdge，catalog number: H-4000) (图2C)
  13. 杂交盒 (LOCK & LOCK) (内置海绵) (图2D)
  14. 去离子水盒 (LOCK & LOCK) (内置海绵) (图2E)
  15. 塑料染色缸 (生工，E678012) (载玻片数量多时可用) 或50 ml离心管 (Thermo Fisher，339652) (载玻片数量少时可用) (图2F, G)
  16. 培养箱 (精宏，catalog number: SHP-250)


    图1. 实验所需仪器. (A) 切片机；(B) 杂交炉；(C) 离心机；(D) 金属浴；(E) 脱色摇床


    图2. 实验所需用品. (A) 盖玻片；(B) 载玻片；(C) 阻水笔；(D) 杂交盒；(E) 去离子水盒；(F) 塑料染色缸；(G) 50ml离心管

实验步骤

注：步骤1、2中所有试剂需保证无RNA酶，具体配方见附录，操作时需佩戴口罩、手套，穿好实验服，实验台面使用75%乙醇擦拭，以避免RNA酶污染。

  1. 原位杂交准备：组织切片
    1.1
    原位杂交前，需要先通过浸泡或灌注的方式固定组织。胚胎或小块的组织可使用4% PFA在4°C浸泡过夜固定。对于大块的成年小鼠组织，如脑组织，则使用1× PBS及4% PFA灌注固定并使用4% PFA在4°C过夜完成后固定。
    1.2
    固定完成后，将组织转移到盛有1× PBS的离心管中，反复颠倒润洗3次，以去除组织表面残留的PFA。
    1.3
    用20%蔗糖溶液去除水分使组织脱水 (约1 d)，组织沉底后换用30%蔗糖溶液脱水至沉底 (约1-2 d)。
    1.4
    将组织擦干后放置于合适大小的模具中，缓慢加入OCT包埋，使OCT完全浸没过组织。
    1.5
    快速将冷冻的组织放置于-80°C下保存，直至切片操作。(或者直接进行冰冻切片)
    1.6
    取出要切片的组织，将其放置于冰冻切片机中至少30 min，使之复温。切片温度通常约为-20°C。
    1.7
    在冰冻切片机中进行组织切片 (厚度为12-22 μm)，将组织切片展平并贴附到载玻片上。
    1.8
    原位杂交前，贴有组织切片的载玻片需要在室温下晾置2 h，再置于50°C干燥15 min，以防切片从载玻片上脱落。需要供以后使用的冷冻组织切片应在室温下干燥大约1 h，随后置于-80°C保存，使用其进行原位杂交前在室温干燥1 h，随后50°C干燥15 min。

  2. 原位杂交-第一天：

    注：染色缸 (离心管) 需用去离子水清洗后放入60°C烘箱烘干，使用前用DEPC处理的去离子水润洗3次。量筒、盖玻片用前需在180°C烘箱中放置2 h。

    2.1
    在染色缸中配制3份200 ml 1× PBS ①②③、1份PK缓冲液、1份1× TAE缓冲液和1份4% PFA。(若使用离心管，每份溶液配制25 ml即可，下同)
    2.2
    在50°C下干燥玻片15-30 min。
    2.3
    常温下，将玻片浸泡于4% PFA中，固定20 min。
    2.4
    常温下，将玻片浸泡于1× PBS①中润洗，然后使用另一份1× PBS②洗5 min。
    2.5
    常温下，将玻片浸泡于含有蛋白酶K的PK缓冲液中润洗10 min。
    2.6
    常温下，将玻片浸泡于1× PBS②中润洗一次。
    2.7
    常温下，将玻片浸泡于4% PFA中固定10 min。
    2.8
    常温下，将玻片浸泡于1× PBS①中润洗，然后用另一份1× PBS②洗5 min。
    2.9
    常温下，将玻片浸泡于0.1 M TEA缓冲液中，处理10 min。
    注：使用磁力搅拌装置，适当转速，也可放于摇床。
    2.10
    常温下，将玻片浸泡于1× PBS②中润洗，然后在1× PBS③中处理5 min。
    2.11
    常温下，将浸泡在1× PBS③中的玻片取出，用纸擦干背面，轻轻敲击载玻片边缘以减少残留的PBS，将载玻片平放到杂交盒中，在组织上滴加预杂交液使其完全浸没组织 (快速操作，保持组织切片湿润)，盖好盒盖，进行1 h的预杂交(图3)。


    图3. 预杂交示意图. (A) 将载玻片平放于杂交盒中；(B) 在玻片上滴加预杂交液使其完全覆盖组织。

    2.12
    将RNA探针加入杂交液中 (杂交液包含0.1-0.2 ng/μl的RNA探针)，在金属浴中85°C处理5 min，使RNA探针成为线性，然后迅速放到冰水混合物上冷却，混匀离心。
    2.13
    用移液枪吸去玻片上的预杂交缓冲液，每张玻片滴加约100 μl杂交液，盖上盖玻片以防止液体蒸干 (图4)。将玻片置于杂交盒中，盖好盒盖，在65°C的杂交炉中继续孵育过夜 (12-16 h)。


    图4. 探针杂交示意图.(A) 将预杂交液替换为杂交液，盖上盖玻片；(B) A图的放大图，显示盖玻片位置。

  3. 原位杂交-第二天：
    3.1
    在染色缸中配制4份200 ml 0.2× SSC、2份200 ml缓冲液B1。
    3.2
    水浴锅中预热3份0.2× SSC至65°C。将载玻片直立，使盖玻片自然滑下。将载玻片浸泡于0.2× SSC溶液中，每份中各洗一次，每次20 min (快速操作，保持组织切片湿润)。
    3.3
    常温下，将载玻片转移到第四份0.2× SSC中，润洗5 min。
    3.4
    常温下，将玻片浸泡于缓冲液B1中，润洗2次，每次5 min。
    3.5
    用纸擦拭玻片边缘，用阻水笔在玻片上画疏水圈 (快速操作，保持组织切片湿润)，平放玻片，每张玻片滴加约200 μl缓冲液B2，使其完全覆盖组织。将玻片转移至水盒中，盖好盒盖，常温下封闭1 h (图5)。


    图5. 封闭示意图. (A) 用阻水笔在组织周围画疏水圈；(B) 在疏水圈内滴加缓冲液B2，平放于水盒中。

    3.6
    用移液枪吸去玻片上的缓冲液B2，滴加缓冲液B2+anti-DIG-AP (1:5,000) (每张玻片约200 μl)。将玻片转移至水盒中，盖好盒盖，4°C继续孵育过夜。

  4. 原位杂交-第三天：
    4.1
    在染色缸中配制3份200 ml 缓冲液B1、2份200 ml缓冲液B3。
    4.2
    常温下，将玻片浸泡于缓冲液B1中润洗3次，每次20 min。
    4.3
    常温下，将玻片浸泡于缓冲液B3中润洗2次，每次5-10 min。
    4.4
    在玻片上滴加200 μl缓冲液B4。
    4.5
    将所有载玻片平放在水盒中，放入28°C培养箱，避光孵育10 min-1 d (显色时间与样品年龄、组织类型以及探针有关，待信号明显且背景没有明显升高时即可停止反应) (图6)。


    图6. 显色结果示意图. (A) 用Fezf2探针显色成功的脑片展示图。可见皮层深层的蓝紫色信号，且背景较低。(B) (A) 图方框所示区域的放大图。比例尺：(A) 200 μm, (B) 20 μm。

    4.6
    常温下，将玻片浸泡于去离子水中终止反应。
    注：如有必要，可将玻片浸泡于100%甲醇中15-30min，以降低背景。不要将INT/BCIP显色的玻片放入甲醇中。
    4.7
    用封片剂封片。

溶液配方

  1. DEPC处理的去离子水 (室温保存)
    去离子水中加入0.1% DEPC，摇匀，避光过夜，灭菌处理。

  2. DEPC处理的10× PBS (室温保存)
    药品分子式分子量储存浓度
    		1 L所需
    氯化钠NaCl58.441.54 M
    		90 g
    七水合磷酸氢二钠Na2HPO4·7H2O268.070.03 M
    		7.95 g
    磷酸二氢钾KH2PO4 136.090.01 M
    		1.44 g
    加入0.1% DEPC，摇匀，避光过夜，灭菌处理。

  3. 4% PFA (-20°C保存)
    药品分子式分子量工作浓度500 ml所需
    DEPC处理的10× PBS\\1x50 ml
    多聚甲醛(HCHO)n(30.03) × n4%20 g
    DEPC处理的去离子水H2O18\补足500 ml
    65°C加热，完全溶解后过滤。

  4. 1 M三乙醇胺 (pH = 8.0，室温保存)
    药品分子式分子量储存浓度500 ml所需
    三乙醇胺(HOCH2CH2)3N149.19\66.5 ml
    DEPC处理的去离子水H2O18\413.5 ml
    浓盐酸HCl36.4612 M20 ml

  5. (预) 杂交缓冲液 (-20°C保存)
    药品分子式分子量工作浓度100 ml所需
    甲酰胺HCONH2 45.0450%50 ml
    柠檬酸钠缓冲液C6H5O7Na3 258.07\25 ml 20×柠檬酸钠缓冲液
    酵母RNA\\250 g/L500 ml 50 mg/ml酵母RNA
    Denharts溶液\\\10 ml 50× Denharts溶液
    鲱鱼精子DNA\\500 g/L5 mg 10 mg/ml鲱鱼精子DNA
    DEPC处理的去离子水H2O18\9.5 ml

  6. DEPC处理的0.5 M乙二胺四乙酸 (EDTA) (pH = 8.0，室温保存)
    药品分子式分子量储存浓度200 ml所需
    乙二胺四乙酸C10H16N2O8 292.24\\
    氢氧化钠NaOH40\调节pH至8.0
    加入0.1% DEPC，摇匀，避光过夜，灭菌处理。

  7. DEPC处理的1 M Tris-HCl (pH = 7.4-7.5，室温保存)
    药品分子式分子量储存浓度500 ml所需
    Tris(HOCH2)3CNH2 121.141 M60.57 g
    浓盐酸HCl36.46\调节pH至7.4-7.5
    去离子水H2O18\补足
    加入0.1% DEPC，摇匀，避光过夜，灭菌处理。

  8. 1 M Tris-HCl (pH = 9.5，室温保存)
    药品分子式分子量储存浓度500 ml所需
    Tris(HOCH2)3CNH2 121.141 M60.57 g
    氢氧化钠NaOH40\调节pH至9.5
    去离子水H2O18\补足

  9. 20x 柠檬酸钠 (pH = 7.0，室温保存)
    药品分子式分子量储存浓度500 ml所需
    氯化钠NaCl58.443 M87.66 g
    柠檬酸钠C6H5O7Na3 258.070.3 M38.71 g
    盐酸HCl36.46\调节pH到7.0
    去离子水H2O18\补足

  10. 1 M 氯化镁 (室温保存)
    药品分子式分子量储存浓度500 ml所需
    六水合氯化镁MgCl2·6H2O203. 31 M101.65 g
    去离子水H2O18\补足

  11. 5 M 氯化钠 (室温保存)
    药品分子式分子量储存浓度500 ml所需
    氯化钠NaCl58.445 M146.1 g
    去离子水H2O18\补足

  12. PK缓冲液 (现配现用)
    药品分子式分子量工作浓度200 ml所需
    乙二胺四乙酸C10H16N2O8 292.240.005 M2 ml 0.5 M乙二胺四乙酸
    Tris-HCl\157.600.05 M10 ml 1 M Tris-HCl
    蛋白酶\\2 mg/ml20 ml 20 mg/ml蛋白酶
    DEPC处理的去离子水H2O18\188 ml

  13. 0.1 M三乙胺醇缓冲液 (现配现用)
    药品分子式分子量工作浓度200 ml所需
    三乙醇胺(HOCH2CH2)3N149.190.1 M20 ml 1 M三乙胺醇 (pH = 8.0)
    乙酸酐(CH3CO)2O102.09\500 μl
    DEPC处理的去离子水H2O18\180 ml

  14. 缓冲液B1 (现配现用)
    药品分子式分子量工作浓度200 ml所需
    Tris-HCl\\0.1 M20 ml 1 M Tris-HCl (pH = 7.4-7.5)
    氯化钠NaCl58.440.15 M6 ml 5 M氯化钠
    去离子水H2O18\174 ml

  15. 缓冲液B2 (现配现用)
    药品分子式分子量工作浓度1 ml所需
    缓冲液B1\\\900 μl
    绵羊血清\\\100 μl

  16. 缓冲液B3 (现配现用)
    药品分子式分子量工作浓度200 ml所需
    Tris-HCl (pH 9.5)\\0.1 M20 ml 1 M Tris-HCl (pH 9.5)
    氯化钠NaCl58.440.1 M4 ml 5 M氯化钠
    氯化镁MgCl2 95.210.05 M10 ml 1 M氯化镁
    吐温20\1227.50.1%1 ml 20% 吐温20
    去离子水H2O18\165 ml

  17. 缓冲液B4 (现配现用)
    药品分子式工作浓度分子量1 ml所需
    缓冲液B3\\\1 ml
    四唑氮蓝/5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸盐C40H30N10O6C12 /C8H4BrClK2NO4P\817.6/402.6520 ml

致谢

感谢侯永洁指导实验操作。

参考文献

  1. Allen Institute for Brain Science. (2011). Technical white paper: in situ hybridization data production.
  2. Hou, Y. J., Chen, Y., Wu, J. Y., Du, Y. Y., Zhang, Q. Q., Zhang, T. R. and He, M. (2018). 小鼠脑组织冰冻切片. https://en.bio-protocol.org/p125.
  3. SCHAERENWIEMERS N, GERFINMOSER A. A (1993). A single protocol to detect transcripts of various types and expression levels in neural tissue and cultured cells: in situ hybridization using digoxigenin-labelled cRNA probes. Histochem 100(6): 431-40.
Copyright: © 2021 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.

Category

Neuroscience > Basic technology

Molecular Biology > RNA > RNA detection

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