Extracting and Processing of piRNA Precursors for Aequencing in Caenorhabditis elegans

研究背景

在秀丽隐杆线虫中，piRNA从基因组上转录出来，加工后会产生长约26 nt且带有5’cap的piRNA前体，经过5’端去帽，以及5’端剪切约2个核苷酸，和3’端剪切等加工步骤，生成长21 nt的成熟piRNA，也称21U-RNA，并与PIWI蛋白PRG-1结合(Batista et al., 2008; Gu et al., 2012; Weick and Miska, 2014; Weng et al., 2019)。为了研究线虫中piRNA的生成过程，需要对piRNA前体进行检测和分析。在small RNA-seq中，需要RNA的5’端是单磷酸，才可以加linker进而反转录建库测序。在检测不同结构类型的piRNA前体的时候，需要用不同的RNA加工酶进行处理，将5’端转变为单磷酸 (图1) (Gu et al., 2012; Cordeiro Rodrigues et al., 2019; Zeng et al., 2019)。本方案对带有5’cap的piRNA前体和不带有5’cap但长于21 nt的piRNA前体进行分析。


图1. 加工酶对不同类型small RNA的加工模式

材料与试剂

一、生物材料

1. 秀丽隐杆线虫（实验室培养）
2. 大肠杆菌OP50（实验室培养）

1. RNase-free离心管50 ml（Corning, catalog number:430828），15 ml（Corning, catalog number:430791），1.5 ml（Nest, catalog number:615001）
2. 普通离心管15 ml，50 ml
3. RNase-free枪头1000 μl，200 μl，20 μl，10 μl（Axygen, catalog number: TF-1000-R-S, TF-200-R-S, TF-20-R-S, TF-10-R-S）
4. 一次性口罩
5. 一次性培养皿直径90 mm，60 mm，35 mm (培养线虫用)

1. MgSO₄ (Sangon Biotech, catalog number: A601988)
2. NaCl (Sangon Biotech, catalog number: A610476)
3. Na₂HPO₄ (Sangon Biotech, catalog number: A501727)
4. KH₂PO₄ (Sangon Biotech, catalog number: A100781)
5. NP-40 (Sangon Biotech, catalog number: A800385)
6. Tris (Sangon Biotech, catalog number: A600194)
7. NaOH (Sangon Biotech, catalog number: A100583)
8. NaClO (国药, catalog number:7681-52-9)
9. MgCl₂ (Sangon Biotech，catalog number: A100288)
10. 10x M9 (配方见表1)
    
    表1.
    

    	Total 1000 ml
    NaCl	50 g
    Na2HPO4	60 g
    KH2PO4	30 g
    ddH20	990 ml
    上述试剂配置完，使用灭菌锅进行120 °C 20min高压灭菌，待溶液冷却后，再加入10 ml 1 M MgSO4

    注：用ddH₂O稀释10x M9 10倍，配置成1x M9使用。
    
    
11. 2x bleach液 (配方见表2)
    
    表2. 
    

    	Total 200 ml
    10 M NaOH	20 ml
    NaClO溶液(活性氯>=5.2%)	80 ml
    ddH2O	ml

    
    
12. DEPC-treated water (Sangon Biotech，catalog number: B50100，预冷)
13. TRIzol (Life technologies，catalog number: 15596026，预冷)
14. Chloroform，氯仿 (索莱宝，catalog number: P1014预冷)
15. 75%乙醇 (100%乙醇:DEPC-treated water 3:1，预冷)
16. Isopropanol，异丙醇 (Sangon Biotech, catalog number: A507048，预冷)
17. RNase inhibitor (Thermo fisher, catalog number: EF0651, storage at -20 °C)
18. DNase I (Thermo fisher, catalog number:18047019, storage at -20 °C)
19. CIAP (Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal，小牛肠道碱性磷酸酶，Invitrogen, catalog number: 18009019, storage at -20 °C) 或者FastAP (Thermo fisher, catalog number: EF0651, storage at -20 °C)
20. RppH (RNA 5’焦磷酸水解酶，Enzymax, catalog number: 88, storage at -80 °C) 或者Tabacco decapping plus 2 (Enzymax, catalog number: 94, storage at -80 °C)

1. 超声破碎管 (Invitrogen, catalog number: Q3285)
2. 裂解缓冲液(配方见表3)
   
   表3.
   

   	stock	Total 500 ml
   0.5% NP-40		2.5 ml
   20 mM Tris pH 7.5	1 M	10 ml
   200 mM NaCl	5 M	20 ml
   2.5 mM MgCl2	1 M	1.25 ml
   10% glycerol		50 ml
   DEPC-treat water		补齐至500 ml

   注：10% glycerol 可稍微加热后量取，裂解缓冲液存放于RNase-free处理的玻璃试剂瓶中，存放于4 °C。

仪器设备

一、实验器皿

1. 玻璃瓶 1000 ml，500 ml，250 ml，100 ml
2. 塑料量筒 500 ml，200 ml，100 ml
3. 玻璃移液管15 ml，25 ml

1. 摇床 (海门其林贝尔, TS-8)
2. 冷冻离心机 (Eppendorf, 5415R)
3. 普通离心机 (Eppendorf, Centrifuge 5702)
4. 37°C烘箱 (上海智诚，ZDP-2120)
5. 冰箱 (20 °C，4 °C，-20 °C，-80 °C)
6. Vortex (IKA，Vortex2)
7. 超声破碎仪 (Diagenode，Bioruptor UCD-200)
8. 体式显微镜 (MOTIC，SMZ168)
9. 电子秤 (梅特勒，AL104)
10. 高温高压灭菌锅 (致微，G154DWS)
11. 电子移液枪 (Eppendorf)
12. 移液枪 (Brand，1000 μl，200 μl，20 μl，2 μl)
13. 真空泵 (海门其林贝尔，GL802B)

实验步骤

实验步骤流程如图2所示。


图2. 实验步骤流程示意图

一、收取线虫样品 (以Late Young Adult时期线虫为例)

1. 使用90 mm培养皿固体培养线虫 (一支样品约需2个培养皿的线虫，约共4000到6000条，由此提供下一代线虫)，待培养皿上线虫数量足够多且大部分到达成虫时期，进行线虫同步化。
   注：提供足够的细菌食物，别让培养皿上线虫进入饥饿状态。
2. 线虫同步化操作
   1. 用电子移液枪和玻璃移液管吸取10 ml 1x M9，将培养皿上的线虫转移到15 ml离心管中。
   2. 转移完成后，将离心管离心 (2,500 rpm，0.5 min)，弃多余液体，在管中保留5 ml液体。再加入5 ml 2x bleach液，在摇床上快速摇晃约5 min (可提前在体式显微镜下观察，大部分虫体破碎即可)，离心(2,500 rpm，0.5 min)，弃上清。
   3. 加入5 ml 1x M9清洗，涡旋混匀，离心 (2,500 rpm，0.5 min)，弃上清，重复此步骤3次。用枪头适度轻柔吹打，将沉淀的虫卵重悬之后，逐滴转移到90 mm培养板上，放置于20 °C恒温培养箱固体培养，约2.5~3.5天后到达年轻成虫后期（不同基因型或者突变背景的线虫品系，到达年轻成虫后期的时间有所不同，以大部分线虫即将产卵或刚开始产卵的时间为准）。
      注：每个板上转移配置的虫卵要适量，防止线虫培养过程中进入饥饿状态。
3. 将同步化后年轻成虫后期的线虫转移到15 ml离心管中，离心 (2,500 rpm，0.5 min)，弃上清 (用真空泵吸出，注意不要将虫子吸出)。加入10 ml 1x M9，放在摇床上缓慢摇晃约10 min，离心 (2,500 rpm，0.5 min)，弃上清，再加入10 ml 1x M9离心 (2,500 rpm，0.5 min)，弃上清。将线虫转移至1.5 ml RNase-free离心管，每管约40 μl虫体（约1000-2000条成虫）。一管虫体作为一份样品。样品需冻存在-80 °C冰箱中。

二、核酸提取
注：后续实验时带好口罩，防止吸入有毒试剂及RNA被污染，实验均用RNase-free枪头，所用离心管均为RNase-free离心管，所有离心均在冷冻离心机中，加试剂间隙尽量将样品放在冰上，建议将所用的1.5 ml 离心管预冷。

4. 取出-80 °C冰箱中的样品，加入1 ml 预冷的裂解缓冲液，待样品融化后（冰上融化），使用冷冻离心机离心 (1,000 rpm, 1 min)，弃上清，留下沉淀及液体约40 μl。
5. 用移液枪打匀并吸取30 μl虫体到500 μl超声破碎管中，加入70 μl 裂解缓冲液，加入RNase inhibitor (4 μl/1000 μl 裂解缓冲液)。
6. 用超声破碎仪 (Biorupter UCD200，15S ON, 45S OFF，Middle level ) 循环6次进行虫体破碎，每两个循环取出样品离心一次，1,000 rpm，1 min。
7. 将100 μl液体转移到1.5 ml 离心管中。
8. 加入400 μl TRIzol (预冷，TRIzol为易挥发有毒试剂，谨防吸入)，涡旋混匀10 s，快速离心10 s。
9. 加入100 μl 氯仿 (预冷，氯仿为易挥发有毒试剂，谨防吸入)，涡旋10 s，冰上静置至少1 min。
10. 用冷冻离心机离心静置后的样品，12,000 rpm 15 min。吸取上清到新的1.5 ml 离心管中 (可以观察到液体分层，上清透明，下层为粉红色，中层有破碎后的虫体等杂质，只吸取透明上清部分，建议将移液枪调到300 μl吸取)。
11. 加入300 μl 异丙醇 (与离心管中的液体体积对等，预冷)，轻微来回颠倒离心管，充分混合液体，放在冰上或4°C冰箱中静置，1h以上。
    注：可以放在4 °C或-20 °C冰箱中过夜静置。
12. 冷冻离心机离心静置后的样品，12,000 rpm 15 min。(可以观察到离心管底部有白色沉淀，此为核酸)
13. 用真空泵吸尽上清（注：也可用移液枪将上清吸尽），加入400 μl 75%乙醇 (预冷)，12,000 rpm离心3 min。洗两次。弃尽上清。
14. 将离心管开盖，让未吸尽的液体蒸发 (3~5 min)，加入20 μl DEPC-treated water (预冷) 溶解核酸。

三、用DNase I消化 (将核酸中的DNA降解，保留RNA)

15. 在核酸溶液中加入DNase I消化体系，静置于37 °C烘箱中，30 min。反应体系如表4：
    
    表4. 
    

    10x DNase I buffer	5 μl
    DNase I	2 μl
    RNA inhibitor	1 μl
    DEPC-treated water	22 μl

    
    
16. 重复步骤8~14。（注：即从加入TRIzol，氯仿至DEPC-treated water溶解核酸的所有步骤）
    
    
    

四、用CIAP酶消化 [将5’三磷酸(5’ ppp-NN)或5’单磷酸(5’ p-NN)消化并生成5’端羟基(5’ OH-NN)，CIAP酶可用FastAP替代]

17. 在核酸溶液中加入CIAP酶或者FastAP酶消化体系，静置于37 °C烘箱中，30 min。反应体系如表5：
    
    表5. 
    

    10x CIAP buffer	5 μl
    CIAP酶	2 μl
    RNA inhibitor	1 μl
    DEPC-treated water	22 μl
    或
    10x FastAP buffer	5 μl
    FastAP酶	2 μl
    RNA inhibitor	1 μl
    DEPC-treated water	22 μl

    
    
18. 重复步骤8~14。（注：即从加入TRIzol，氯仿至DEPC-treated water溶解核酸的所有步骤）
    
    
    

五、用RppH酶消化 [将5’ cap三磷酸(5’ Gppp-NN)消化并生成5’ 单磷酸(5’ p-NN)，RppH酶可用Tabacco decapping plus 2酶替代]

19. 在核酸溶液中加入RppH酶或者Tabacco decapping plus 2 酶消化体系，静置于37 °C烘箱中，60 min。反应体系如表6：
    
    表6.
    

    10x RppH buffer	5 μl
    RppH酶	2 μl
    RNA inhibitor	1 μl
    DEPC-treated water	22 μl
    或
    10x Tabacco buffer	5 μl
    Tabacco decapping plus 2酶	2 μl
    RNA inhibitor	1 μl
    DEPC-treated water	22 μl

    
    
20. 重复步骤8~14。（注：即从加入TRIzol，氯仿至DEPC-treated water溶解核酸的所有步骤）

六、Small RNA-seq
注：如需检测带有5’cap的piRNA前体，做完第20步后测序；如需检测成熟piRNA或者不带有5’cap的piRNA前体，跳过17~20步后测序。

21. 将RNA溶液送测序公司，每个RNA样品3 μg即可，选择RNA条带大小为18~ 40nt，使用NEBNext ^®Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina试剂盒进行建库，将建库得到的DNA使用安捷伦生物分析仪2100进行分析后，进行单端测序。(注：可将样品送至测序公司，进行测序和测序)

致谢

该文章得到了国家重大科学研究计划 (批准号：2018YFC1004500和2017YFA0102900)、国家自然科学基金 (批准号：31671346，91940303，31870812，31871300， 31900434) 的支持。该实验方案改编自光寿红教授课题组的实验操作手册，在此向该实验室的老师和同学们表示感谢；使用该实验方案发表的文章 (Zeng et al., 2019)。

参考文献

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2. Cordeiro Rodrigues, R. J., de Jesus Domingues, A. M., Hellmann, S., Dietz, S., de Albuquerque, B. F. M., Renz, C., Ulrich, H. D., Sarkies, P., Butter, F. and Ketting, R. F. (2019). PETISCO is a novel protein complex required for 21U RNA biogenesis and embryonic viability. Genes Dev 33(13-14): 857-870.
3. Gu, W., Lee, H. C., Chaves, D., Youngman, E. M., Pazour, G. J., Conte, D., Jr. and Mello, C. C. (2012). CapSeq and CIP-TAP identify Pol II start sites and reveal capped small RNAs as C. elegans piRNA precursors. Cell 151(7): 1488-1500.
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