RNA Immunoprecipitation (RIP)

材料与试剂

1. 1.5 ml离心管 (上海生工生物，catalog number: F601620-9001)
2. 2 ml RNase-free离心管 (生工，catalog number: F601620-9001) 
3. 1 ml RNase-free枪头 (KIRGEN，catalog number: KG1333) 
4. RiboLock RNase Inhibitor (Thermo ScientificTM, catalog number: EO0382)
5. cOmplete^TM, Mini Protease Inhibitor Cocktail (Roche, catalog number: 04693124001)
6. Phosphatase Inhibitor Cocktail (ApexBio, catalog number: K1014)
7. Pierce^TM Protein A/G Plus Agarose (Thermo ScientificTM, catalog number: 20423)
8. Primary antibody (根据实验需求，选择)
9. TRIzol^TM Reagent (InvitrogenTM, catalog number: 15596018)
10. Superase.IN (InvitrogenTM, catalog number: AM2694)
11. GlycoBlue (InvitrogenTM, catalog number: AM9516)
12. Proteinase K (InvitrogenTM, catalog number: 25530015)
13. 水饱和酚 (InvitrogenTM, catalog number: AM9710)
14. 氯仿 (国药, catalog number: 10006818)
15. 无水乙醇 (国药, catalog number: 10009218)
16. 异戊醇 (国药, catalog number: 10003218)
17. IgG (CST, 根据一抗来源)
18. Tris (生工，catalog number: A501492-0005) 
19. NaCl (生工，catalog number: A501218-0001) 
20. MgCl₂ (国药，catalog number: 10012818) 
21. NP-40 (生工，catalog number: A100109-0100) 
22. SDS (麦克林，catalog number: 151-21-3) 
23. Sodium deoxycholate (sigma，catalog number: 30970-25G) 
24. Na₂HPO₄·12H₂O (国药，catalog number: 10020318) 
25. KH₂PO₄ (生工，catalog number: A100781-0500) 
26. 醋酸钠 (生工，catalog number: A110530-0500) 
27. DEPC (Sigma，catalog number: D5758-25ML) 
28. 1x RIPA裂解液 (见溶液配方)
29. Proteinase K buffer (见溶液配方)
30. NT2 buffer (见溶液配方)
31. 10x PBS (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 15 cm 细胞培养皿 (Excell，catalog number: CS016-0129) 
2. 细胞刮刀 (阿拉丁，catalog number: C6587-01-10A) 
3. -80 °C冰箱
4. 小型低温离心机
5. Thermomixer
6. 移液器
7. 旋转仪
8. Vortex
   

实验步骤

一、准备样品

1. 取一盘15 cm培养皿培养的MDA-MB-231细胞 (细胞密度约80%-90%)，用移液器吸去培养液，放置于冰上，加入5 ml冰冷的1x PBS，轻轻晃动，用移液枪吸去1x PBS。
2. 加入2 ml冰冷的1x PBS，用细胞刮刀将细胞刮下来，并转移到2 ml离心管中。在4 °C 2,500 rpm的条件下离心5 min，用移液枪吸出上清。
3. (可选择) 将细胞在液氮中短暂冷冻后，保存于-80 °C冰箱中。

1. 往细胞中加入1.5 ml 1x RIPA裂解液 (加入50 U/ml RiboLock RNase Inhibitor、50 U/ml Superase.IN、1x Protease Inhibitor Cocktail和1x Phosphatase Inhibitor Cocktail)，轻轻吹打重悬细胞，冰上孵育20 min，在4 °C 12,000 rpm的条件下离心15 min，取上清于新的2 ml离心管中。
2. 取10 µl蛋白裂解液标记“Input”，存放在-80 °C冰箱中直到进行第四步实验时取出，与IP样品同步进行RNA纯化实验。
3. (可选) 取10 µl的蛋白裂解液用于Western blot。
   
   
   

1. 将剩余蛋白裂解液均分成两份，每份740 µl。一份加入适量蛋白抗体，另一份加入等量的IgG作为阴性对照，在4 °C旋转孵育4 h。
2. 取60 µl Protein A/G PLUS-Agarose beads，1 ml NT2 buffer旋转洗涤10 min，在4 °C 3,000 rpm的条件下离心5 min，重复洗涤3次。
3. 将beads均分成两份，每份500 µl，去掉上层的NT2 buffer，分别将与抗体孵育的细胞裂解液加入到beads中，在4°C旋转孵育过夜。
4. 洗涤beads。
   4.1

   在离心管中加入1 ml NT2 buffer，4 °C旋转洗涤5 min，在4 °C 3,000 rpm的条件下离心5 min去掉上清液。
   4.2

   重复上述步骤2次。
   4.3

   (可选) 在最后一次洗涤beads时，在离心管中加入1 ml NT2 buffer，取出1/15体积beads于新的离心管中用于Western blot检测。

1. 准备proteinase K buffer
   每个样品中加入150 µl proteinase K buffer：117 µl NT2 buffer，15 µl 10% SDS，18 µl 10 mg/ml proteinase K。
2. 将步骤三中的beads，在4 °C 3,000 rpm的条件下，离心5 min，吸去上清液，每个样品中加入150 µl proteinase K buffer重悬beads，将样品放在Thermomixer中1,000 rpm，55 °C反应30 min，消化蛋白。
   
3. 将样品放入4 °C离心机中，在3,000 rpm条件下，离心5 min，上清液转移到新的1.5 ml离心管中，加入250 µl NT2 buffer，至样品总体积为400 µl。
   
   
   

1. 加入400 µl苯酚:氯仿:异戊醇 (125:24:1) 混合液，vortex震荡15 s，14,000 rpm室温离心10 min。
2. 上层水相 (约350 µl) 转移到新的1.5 ml离心管中，加入等体积的氯仿，vortex震荡15 s，14,000 rpm室温离心10 min。
3. 上层水相 (约300 µl) 转移到新的1.5 ml离心管中，加入0.5 µl GlycoBlue，混匀；加入1/10体积的醋酸钠，混匀；再加入2.5倍体积的无水乙醇，混匀，-80 °C冰箱中沉淀1 h或者-20 °C冰箱中沉淀过夜。
4. 在4°C 14,000 rpm条件下离心30 min，弃掉上清。
5. 用80%的乙醇洗涤RNA沉淀，在4 °C 14,000 rpm条件下离心15 min，弃掉上清，室温放置待乙醇完全挥发。
6. 加入20 µl DEPC水溶解RNA，存放在-80 °C冰箱中，或者进行反转录实验、RT-qPCR检测。

溶液配方

1. NT2 buffer
   50 mM Tris-HCl pH7.5
   150 mM NaCl
   1 mM MgCl₂
   0.05% NP-40
2. 1x RIPA Buffer
   0.5% sodium deoxycholate
   50 mM Tris-HCl (pH 7.5)
   150 mM NaCl
   1% NP-40
   0.1% SDS
3. 10x PBS buffer
   NaCl 40 g
   KCl 1 g
   Na₂HPO₄·12H₂O 17.9 g
   KH₂PO₄ 1.35 g
   水定容至500 ml
   注：本实验中所有试剂均为用DEPC处理水配制，用到的仪器均用RNaseZap湿巾擦拭；实验操作过程中，戴一次性口罩、帽子、手套，避免RNase污染。
   

致谢

我们感谢中国自然科学基金 (81672791, 81872300) 和浙江省杰出青年自然科学基金(LR18C060002) 对我们实验工作的支持，同时也感谢实验室各位成员之间在科研工作中的密切协作和配合，使得我们的实验能够顺利，稳定进行。