Capturing the RNA Binding Proteins of Newly Transcribed RNA by Click Chemistry

材料与试剂

1. 低吸附离心管 (Eppendorf，catalog number: 30108051) 
2. HeLa细胞 (ATCC, catalog number: CCL-2TM) 
3. 胎牛血清 (NTC，catalog number: SFBE) 
4. DMEM高糖培养基 (Hyclone，catalog number: SH30022.01) 
5. 1x DPBS basic (Dulbecco's phosphate-buffered saline, Gibco, catalog number: C14190500BT)
6. 无RNase/DNase超纯蒸馏水 (Thermo，catalog number: 10977023) 
7. 5-乙炔基尿苷 (5-ethynyluridine，EU；Ribobio，catalog number: C00065) (溶于DMSO配制为0.1 M的母液，可避光保存于-20 °C长达半年) 
8. 叠氮修饰生物素 (Biotin-azide, Ribobio, catalog number: C00101-50mg) (溶于DMSO配制为0.25 M的母液，可保存于-20 °C长达半年) 
9. 乙醇 (西陇科学，574，catalog number: 64-17-5) 
10. TritonX-100 (Sigma-Aldrich，catalog number: T9284) 
11. 硫酸铜 (CuSO₄，Sigma-Aldrich，catalog number: 451657) (溶于无RNase/DNase超纯蒸馏水配制为0.5 M的母液，现配现用) 
12. 三 (3-羟丙基三氮基甲基) 胺 (Tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine THPTA；Sigma-Aldrich，catalog number: 762342) (溶于DMSO配制为0.25M的母液，可避光保存于-20 °C长达半年) 
13. 氨基胍盐酸盐 (Aminoguanidine，Sigma-Aldrich，catalog number: 396494) (溶于无RNase/DNase超纯蒸馏水配制为0.5 M的母液，可避光保存于-20 °C长达半年) 
14. (+)-抗坏血酸钠L (Sodium L-ascorbate，Sigma-Aldrich，catalog number: 11140) (溶于DPBS配制为0.1 M的母液，现配现用) 
15. 1 M Tris-HCl，pH7.5 (Invitrogen，catalog number: 15567-027) 
16. 氯化锂 (LiCl；Sigma-Aldrich，catalog number: 62476) 
17. 十二烷基硫酸锂 (LiDS；Sigma-Aldrich，catalog number: L9781) 
18. DL-二硫苏糖醇 (DTT；Sigma-Aldrich，catalog number: D0632) 
19. 无EDTA-蛋白酶抑制剂 (Roche，catalog number: 04693132001) 
20. RNA酶抑制剂 (RRI； TaKaRa， catalog number: 2313A) 
21. 链霉亲和素磁珠 (Thermo Fisher Scientific，catalog number: 65602) 
22. 甲酰胺 (Sigma-Aldrich，catalog number: 47671) 
23. 1 M Tris-HCl，pH 7.0 (Invitrogen，catalog number: AM9851) 
24. 蛋白酶K (New England Biolabs，catalog number: P8107S) 
25. RNase A (Sigma-Aldrich，catalog number: R4875) 
26. TRI Reagent试剂 (MRC，catalog number: TR-118-200) 
27. 氯仿 (美国CIL，catalog number: 865-49-6) 
28. 异丙醇 (大茂，PG13302，catalog number: 67-63-0) 
29. 糖原 (Roche，catalog number: 10901393001) 
30. 5 M NaCl溶液 (Invitrogen，catalog number: AM9759)
31. 青霉素-链霉素双抗溶液 (Hyclone，catalog number: SV30010)
32. 10% 十二烷基硫酸钠溶液 (10% SDS；Invitrogen，catalog number: 24730020)
33. 0.5 M EDTA溶液，pH 8.0 (Invitrogen，catalog number: 15575020)
    

仪器设备

1. 10厘米 (cm) 细胞培养皿 (Greiner，catalog number: 664160) 
2. 二氧化碳培养箱 (Thermo Fisher Scientific，catalog number: 4111) 
3. 无菌超净工作台 (ESCO，catalog number: ACB-4A1) 
4. 紫外交联仪 (新芝，catalog number: SCIENTZ 03-II) 
5. 胰岛素注射器 (BD，catalog number: 328421) 
6. 2毫升 (ml) 免疫磁珠磁力架 (invitrogen，catalog number: 12321D) 
7. 垂直混匀仪 (新芝，catalog number: HS-3) 
8. 小型冷冻离心机 (Eppendorf，catalog number: 5424R) 
9. 振荡型恒温金属浴 (博日，catalog number: MB-102) 
10. 转移脱色摇床 (其林贝尔，catalog number: TS-8S) 
11. 细胞刮 (Greiner，catalog number: 541070)
    

实验步骤

1. 细胞培养和EU处理细胞
   在10 cm培养皿中培养HeLa细胞，待HeLa细胞增殖扩大到3皿，并且其密度约为80% 时，加入EU至终浓度为0.25 mM，并继续培养16 h。
2. UV交联
   1. 移除培养皿中的培养基，用4 °C预冷的DPBS清洗HeLa细胞三次，倾斜培养皿，用移液枪彻底去除培养皿中的DPBS残液。
   2. 将装有冰的大小合适的托盘直接放到交联仪器中，再将去除DPBS后的细胞培养皿平放于冰上，拿出培养皿盖，随后在0.15 J/cm²、254 nm的紫外灯下对细胞进行交联 (培养皿与紫外灯距离大约5-7 cm)。
3. 固定细胞
   在每一个10 cm培养皿中加入5 ml 90% 的预冷乙醇，并将其平放于冰上固定30 min。
4. 配制点击化学反应的反应液 (以下简称为click反应液)
   以一个10 cm培养皿为例，按照下表1的顺序配制click反应液。
   
   表1. 配制click 反应液
   

   反应液成分	体积		母液浓度
   DPBS	9.44 ml	---
   biotin-azide	10 μl	0.25 M
   CuSO4	6 μl	0.5 M
   THPTA	24 μl	0.25 M
   aminoguanidine	20 μl	0.5 M
   sodium L-ascorbate	500 μl	0.1 M
   总体积	10 ml	---

   
   
5. 细胞透化
   1. 固定后的细胞用预冷的DPBS洗3次，置于摇床，使用40 rpm的转速，室温左右平摇，每次5 min。
   2. 在每一个10 cm培养皿中加入5 ml细胞通透液 (见溶液配方)，并将其置于冰上，对细胞进行通透处理15 min。
   3. 细胞通透完成后，用预冷的DPBS洗3次，置于摇床，使用40 rpm的转速，室温左右平摇，每次5 min。
6. click反应
   移除培养皿中所有的DPBS残液，并在每个培养皿中加入10 ml click 反应液，室温孵育3 min。
7. 终止click反应
   1. 移除培养皿中的click反应液，加入预冷的click反应终止液 (见溶液配方) 清洗细胞3次，置于摇床，使用40 rpm的转速，室温左右平摇，每次5 min。
   2. 用预冷的 DPBS 清洗细胞2次，置于摇床，使用40 rpm的转速，室温左右平摇，每次5 min。
8. 裂解并收集细胞
   1. 在每一个培养皿中加入 1 ml 裂解缓冲液 (见溶液配方)，并将培养皿平放于冰上，充分裂解15 min。
   2. 用细胞刮将细胞刮下，转移到1.5 ml 离心管中，用27 G的胰岛素注射器反复抽打细胞5次，进一步裂解细胞。
   注意：此步骤收集的细胞裂解液可以经液氮速冻保存于-80 °C冰箱，但要避免反复冻融。
9. 准备亲和素偶联的磁珠
   按照每1 ml细胞裂解液中加入100 μl 亲和素偶联的磁珠的用量准备磁珠，用0.5 ml 裂解缓冲液清洗100 μl磁珠3次，并按照原来珠子混悬液的体积再用同体积的裂解缓冲液重悬。
10. 分离RNA-蛋白质复合物
    1. 充分裂解后的细胞裂解液在12,000 × g，4 °C 条件下离心10 min，吸取上清并转移到一个新的1.5 ml 离心管中。
    2. 加入与上清等体积的裂解缓冲液稀释，并吸取总体积5% 的样本量至一个新的1.5 ml 离心管中，作为后续质控实验——Western Blotting或者银染的上样阳性对照 (Input)。
    3. 在稀释后的细胞裂解液中加入前一步骤准备好的磁珠，将此混合物置于4 °C冰箱或者冷库中的垂直混匀仪上旋转孵育2 h，转速为10 rpm。
    4. 孵育结束后将离心管置于磁珠分离架，静置5 min，待磁珠与溶液分离后，弃上清液。 
    5. 从磁力架上取下离心管，并于每管加入1 ml 裂解缓冲液，完全重悬磁珠后，于4 °C冰箱或冷库的垂直混匀仪上旋转清洗磁珠10 min，转速为15 rpm (之后步骤涉及垂直混匀仪清洗均按照此条件)。 
    6. 清洗磁珠结束后，重复以上步骤d。
    7. 从磁力架上取下离心管，并于每管加入1 ml 洗涤缓冲液1 (见溶液配方) 重悬磁珠，于4 °C冰箱或冷库的垂直混匀仪上旋转清洗磁珠10 min，重复此步骤2次。 
    8. 参照步骤g，再分别用洗涤缓冲液2 (见溶液配方) 和洗涤缓冲液 3 (见溶液配方) 各清洗磁珠2次。 
    9. 最后一次洗涤结束后，即洗涤缓冲液3洗涤的第2次，从垂直混匀仪上取下离心管，吸取10% 的磁珠-细胞裂解液复合物，用以检测RNA富集的效率，余下的90%用于质谱技术鉴定分离出来的蛋白。
11. 分离RNA
    1. 将含有10% 磁珠的离心管置于磁珠分离架，待磁珠分离完成后，完全移除上清液。
    2. 每管加入50 μl RNA 洗脱缓冲液 (见溶液配方) 重悬磁珠。
    3. 将离心管置于90 °C的恒温震荡仪，1000 × g，震荡洗脱5 min。
    4. 加入等体积 2x 蛋白酶K消化缓冲液 (见溶液配方) 以及100 μg蛋白酶K (母液浓度为20 mg/ml) , 于55 °C恒温金属浴中震荡孵育2 h，转速1000 rpm。
    5. 孵育结束后，加入 1 ml TRI Reagent试剂，剧烈混合均匀。 
    6. 加入200 μl 氯仿，上下剧烈颠倒混匀约15 s，室温静置5 min。
    7. 12,000 × g，4 °C离心15 min。
    8. 用移液器小心吸取上清至一个新的1.5 ml 离心管中, 加入 1 μl 储存浓度为 20 mg/ml 的糖原和等体积的异丙醇, 充分混匀后, 在 -20 °C沉淀RNA过夜。
    9. 次晨将沉淀过夜的RNA离心，12,000 × g，4 °C离心15 min，移除异丙醇。
    10. 用75% 的乙醇清洗沉淀，12,000 × g， 4 °C离心15 min，移除乙醇，再重复此步骤一次。
    11. 用移液器充分移去乙醇，空气干燥RNA至其透明，加入15 μl 无RNase/DNase超纯蒸馏水溶解 RNA 用于以后续 RT-qPCR 及测序分析。
12. 分离蛋白质
    1. 将第10步中余下含有90% 磁珠的离心管置于磁珠分离架，待磁珠分离完成后，完全移除上清液，加入200 μl 蛋白洗脱液 (见溶液配方) 重悬磁珠。
    2. 加入 100 U 的RNase A，在37 °C的恒温震荡仪上，1000 × g，震荡洗脱1 h，转速为1000 rpm。
    3. 12,000 × g，4 °C 瞬时离心，随后在95 °C加热器上加热5 min，再置于冰上。 
    4. 12,000 × g，4 °C 离心5 min，将离心管置于磁珠分离架，待磁珠分离完成后，转移上清至一个新的1.5 ml 离心管中，用于后续质谱检测分析。

溶液配方

1. 蛋白酶抑制剂溶液：取一片蛋白酶抑制剂片剂，用500 μl 商业化无RNase/DNase超纯蒸馏水溶解，配制成100x 母液，使用时按照1:100的比例加入，可保存于
   -20 °C长达半年。
2. 细胞通透液：用商品化的DPBS溶液配制终浓度为0.5% Triton X-100 (v/v) 的细胞通透液。
3. click反应终止液：用商品化的DPBS溶液配制终浓度分别为0.5% Triton X-100 (v/v) 以及2 mM EDTA的click反应终止液。
4. 裂解缓冲液：
   用商品化的无RNase/DNase超纯蒸馏水配制终浓度分别如下的裂解缓冲液，可放于4 °C储存，使用前加入DTT、蛋白酶抑制剂 (按照体积比1:100使用) 和RNase抑制剂 (母液浓度为40 U/μl，按照体积比1:200使用)，以下是具体配方：
   20 mM Tris-HCl, pH 7.5
   500 mM LiCl
   1 mM EDTA, pH 8.0
   0.5% LiDS (w/v)
   5 mM DTT (使用前加入) 
5. 洗涤缓冲液1：
   用商品化的无RNase/DNase超纯蒸馏水配制终浓度分别如下的洗涤缓冲液，可放于4 °C储存，使用前加入DTT，以下是具体配方：
   20 mM Tris-HCl, pH 7.5
   500 mM LiCl
   1 mM EDTA, pH 8.0
   0.1% LiDS (w/v)
   5 mM DTT (使用前加入) 
6. 洗涤缓冲液2 ：
   用商品化的无RNase/DNase超纯蒸馏水配制终浓度分别如下的洗涤缓冲液，可放于4 °C储存，使用前加入DTT，以下是具体配方：
   20 mM Tris-HCl, pH 7.5
   500 mM LiCl
   1 mM EDTA, pH 8.0
   5 mM DTT (使用前加入) 
7. 洗涤缓冲液 3：
   用商品化的无RNase/DNase超纯蒸馏水配制终浓度分别如下的洗涤缓冲液，可放于4 °C储存，使用前加入DTT，以下是具体配方：
   20 mM Tris-HCl, pH 7.5
   200 mM LiCl
   1 mM EDTA, pH 8.0
   5 mM DTT (使用前加入) 
8. RNA 洗脱缓冲液
   用商品化的无RNase/DNase超纯蒸馏水配制终浓度分别如下的缓冲液：
   10 mM EDTA, pH 8.0
   95% formamide
9. 2x蛋白酶K消化缓冲液：
   用商品化的无RNase/DNase超纯蒸馏水配制终浓度分别如下的缓冲液，可放于4 °C储存，使用前加入蛋白酶K，以下是具体配方：
   2 mM Tris-HCl，pH 7.0
   20 mM NaCl
   0.2 mM EDTA，pH 8.0
   0.1% SDS
   1 mg/ml蛋白酶K (使用前加入) 
10. 蛋白洗脱缓冲液：
    用商业化的无RNase/DNase超纯蒸馏水配制终浓度分别如下的缓冲液，现配现用，使用时每个样本加入100 U RNAse A 消化，以下是具体配方：
    20 mM Tris-HCl，pH 7.0
    1 mM DTT
    1% SDS
    

致谢

该项目得到了国家重点研究开发项目 (2016YFA0100701)，广州市珠江科技新星项目 (201610010107) 以及中国科学院青年创新促进会项目 (2015294) 的支持。以下是基于本方法发表的文章Bao, X., Guo, X., Yin, M., Tariq, M., Lai, Y., Kanwal, S., Zhou, J., Li, N., Lv, Y., Pulido-Quetglas, C., Wang, X., Ji, L., Khan, M. J., Zhu, X., Luo, Z., Shao, C., Lim, D., Liu, X., Li, N., Wang, W., He, M., Liu, Y. L., Ward, C., Wang, T., Zhang, G., Wang, D., Yang, J., Chen, Y., Zhang, C., Jauch, R., Yang, Y. G., Wang, Y., Qin, B., Anko, M. L., Hutchins, A. P., Sun, H., Wang, H., Fu, X. D., Zhang, B. and Esteba, M. A. Capturing the interactome of newly transcribed RNA Nat Methods 2018. 15(3): p. 213-220.

参考文献

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3. Castello, A., Fischer, B., Eichelbaum, K., Horos, R., Beckmann, B. M., Strein, C., Davey, N. E., Humphreys, D. T., Preiss, T., Steinmetz, L. M., Krijgsveld, J. and Hentze, M. W. (2012). Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins. Cell 149(6): 1393-406.
4. Baltz, A. G., Munschauer, M., Schwanhäusser, B., Vasile, A., Murakawa, Y., Schueler, M., Youngs, N., Penfold-Brown, D., Drew, K., Milek, M., Wyler, E., Bonneau, R., Selbach, M., Dieterich, C. and Landthaler, M. (2012). The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts. Mol Cell 46(5): 674-90.
5. Bao, X., Guo, X., Yin, M., Tariq, M., Lai, Y., Kanwal, S., Zhou, J., Li, N., Lv, Y., Pulido-Quetglas, C., Wang, X., Ji, L., Khan, M. J., Zhu, X., Luo, Z., Shao, C., Lim, D. H., Liu, X., Li, N., Wang, W., He, M., Liu, Y. L., Ward, C., Wang, T., Zhang, G., Wang, D., Yang, J., Chen, Y., Zhang, C., Jauch, R., Yang, Y. G., Wang, Y., Qin, B., Anko, M. L., Hutchins, A. P., Sun, H., Wang, H., Fu, X. D., Zhang, B. and Esteban, M. A. (2018). Capturing the interactome of newly transcribed RNA. Nat Methods 15(3): 213-220.