Protocols of Field Collection, Specimen Preparation and Community Analysis of Earthworms

研究背景

土壤生物多样性是维持生态系统结构、功能与稳定性的基础，是保障土壤健康，促进农业绿色发展和增强生态文明的基石 (Brussaard et al., 2007; Bardgett et al., 2014; Bender et al., 2016)。其中，蚯蚓是大型土壤动物的代表性类群，被誉为“生态系统工程师”及农田“耕耘者”，在促进有机物分解和碳氮养分循环、改善土壤结构、调控植物生长、调节气候变化等多方面起到重要作用 (张卫信等, 2007; Blouin et al., 2013; Liu et al., 2019)。蚯蚓种类丰富，世界上已发现的蚯蚓超过6000种 (Csuzdi, 2012)。蚯蚓分布极广，除了极地和沙漠等极端气候区域，在世界大部分地区均有分布 (Phillips et al., 2019)。尽管如此，有关蚯蚓的物种组成、地理分布格局及其生态功能机制却缺乏足够的认识，其中一个重要的原因在于蚯蚓多样性调查或群落分析仍缺乏成熟的研究方法，且不同研究者所采取的研究方法仍存在较大差异 (Bartlett et al., 2010)。根据2022年《国务院关于开展第三次全国土壤普查的通知》及农业农村部《第三次全国土壤普查工作方案》，第三次全国土壤普查明确将蚯蚓作为调查对象进行土壤生物指标测试。初步的调查目标包括群落的物种组成、数量特征和分布等量化指标，这些指标看似简单，实则突破了以往生物学学科单纯以蚯蚓标本获取和物种鉴定为目标的约束，当前则更多地考虑了蚯蚓的功能组成和指示土壤质量和健康的地位。因此，这对蚯蚓的采样调查和分析技术提出了较高的要求。考虑到当前蚯蚓采集、标本制作与保存及鉴定都缺乏专业技术人才，亟需规范蚯蚓群落野外调查与室内分析技术，促进科研工作者和技术员及时了解蚯蚓群落调查技术流程。
      准确的野外调查取样、室内标本制作与保存、蚯蚓物种鉴定流程、数据统计与分析技术是提高蚯蚓群落数据可靠性的关键。在调查之前，选择合适的采样点是保证工作顺利进行的前提条件，需要遵循随机和等量的总体原则，并在空间距离和时间尺度上保持相对一致。蚯蚓野外调查方法主要包括挖掘法 (手拣法)、电击法和驱虫剂法等 (陈义，1956；Singh et al., 2016)，但不同调查方法的研究效果不同，在选择时应当提前了解不同方法的优缺点和适用条件，并结合样地的实际环境以及调查目标等因素综合考虑。蚯蚓的物种组成和时空分布受到外界环境和自身生活史等因素的影响，因此要考虑天气状况、土壤性质、蚯蚓生长等因素，选择合适的采样时间和空间位置，以便充分反映典型生境下的蚯蚓群落。蚯蚓采集完成后，完好的蚯蚓标本是后续物种鉴定正常进行的前提条件，制作精良的标本可以长期完整保存，为未来的相关研究提供历史资料。目前蚯蚓物种鉴定主要依赖传统形态学分类方法，但近些年不断发展的分子生物学方法逐渐成为物种鉴定的有力工具 (Avise et al., 1984; Dawnay et al., 2007)，有效补充了传统形态学分类鉴定的不足。在获取蚯蚓群落组成等相关信息后，需借助多种现代数据分析手段尤其是利用多元数据统计技术对蚯蚓群落进行系统分析，主要包括群落组成的相似性和差异性、群落物种或性状的多样性信息和生物指示者的筛选，以便更全面地表征蚯蚓群落组成、结构、多样性和其他性状的变化，并通过筛选敏感种指示其所在的环境或生态系统的变化。
      综上，针对蚯蚓群落野外调查、标本制作和群落分析流程的迫切需求，本文基于前人的研究和研究团队多年的蚯蚓调查实践经验，总结完善了蚯蚓研究方法的基本流程。本文从蚯蚓野外调查样点的选择、采集方法、室内标本制作与保存、物种鉴定和数据分析等方面对蚯蚓主要研究过程进行详细阐述，满足当前农田蚯蚓的普查技术需求，并结合研究者对全球变化扰动下蚯蚓群落的动态变化的研究目标，兼顾了不同生态系统类型或不同土地利用方式下蚯蚓群落调查的需求，以期为今后蚯蚓调查流程的不断完善奠定基础，也为蚯蚓生态学研究工作的深入开展提供技术参考。

实验步骤

一、采样点布设
提前了解采样区域的基本自然情况，布设采样点或规划采样位置，选择合适的采样面积或采样单元，以期反映采样点周围的生态环境。

1. 样点布设原则
   为获取有代表性的样品，样点的选择必须遵循随机和等量的原则。对于一般区域蚯蚓野外调查采样，所选取的调查样点能够代表该区域内土壤环境质量状况，尽量避免选择一些污染严重或历史不明的样点。同时样地数量应等量一致，并保持一定的空间隔离，如空间直线距离不低于3 km或样地之间被明显的道路、河流、沟渠等隔离。另外，布设样点还应考虑采样现场的实际情况，如人身安全、交通便利等，以提高样品的代表性、最大限度节约人力和物力。
   除了空间上的布点要求外，在一些长期定位监测或调查实验中还应考虑采样时间和采样频率。由于不同季节温度和降水等气候条件直接影响蚯蚓的活动分布状况，一般选择蚯蚓活动较为旺盛的季节，如初夏，以便更好地采集蚯蚓样品并反映其蚯蚓群落水平的真实性。对于一些连续动态调查采样，采样时间和采样频率应保持前后一致，以便进行比较和减少误差。
2. 确定样点数量
   采样点的数量应根据采样区域内地形地貌、面积大小或污染状况而定。一般来说采样面积小于3600 m²，采样点数目为5~10个，若其面积大于3600 m²，采样点数量则适当增加。而对于河流沿岸等区域进行布点时，除了考虑空间水平距离外，如每3 km设置1个采样点，还应在河流断面等特殊位置适当增加样点数量。
3. 样点布设方法
   一般蚯蚓采样点的布设，可参考土壤采样点的布设方法 (鲁如坤, 2000)，如梅花形布点法、蛇形布点法等，并尽量避开路边、沟垄、肥堆等特殊位置。由于蚯蚓和土壤本身在空间分布上并不均匀，因此每个采样点进行多点采样，混合均匀，使样品具有代表性。

二、蚯蚓野外调查
野外调查主要进行蚯蚓的采集、环境信息的记录和相关人员的走访工作，需要在合适的季节和时间进行，以保证蚯蚓的采集效果。蚯蚓常栖息于温暖、湿润、有机质较为丰富的土壤中，温度过低或过高容易导致蚯蚓休眠或死亡 (Edwards and Bohlen, 1996)，因此一般选择春末夏初或者秋末冬初采样，并在一天中选择上午10点之前或者下午4点之后采样，避开干旱期和高温期。另外，考虑到蚯蚓形态鉴定需要，使其易于辨别和鉴定，调查采样时间应选择蚯蚓生长和繁殖较为旺盛的时期，一般在春夏之交相匹配。由于土壤较高的空间异质性，应在采样区域多点采样，避免无法采集到蚯蚓。此外，尽管蚯蚓主要栖息在土壤表层0~20 cm内，但蚯蚓在土壤动物中属于移动能力较强的类型，如深栖型蚯蚓甚至在地下1米到2米范围仍有活动 (Bouché, 1977)；因此正式进行蚯蚓调查时，应该首先对调查区域蚯蚓的生态型有初步的了解，否则单纯的调查土壤表层，可能会遗漏土壤下层的蚯蚓。

1. 野外采集记录
   1.1

   材料与工具
   记号笔、写字板、样点信息记录表 (附表1)、GPS定位仪、照相机、地温仪等
   1.2

   操作步骤
   (1) 样点布设完毕后，利用GPS定位仪对样地地理位置进行定位，得到经纬度、海拔等有效数据，记录地形、天气、气温和采样时间等情况；
   (2) 将地温仪插入土壤20 cm深，打开，待表盘示数稳定后，记录读数；
   (3) 观察样地环境，记录样地的土壤类型、主要植被类型等信息，而对于受人为干扰严重的样地，如农田，还可询问当地农民有关样地的种植制度、肥料施用量、作物产量及工业活动等基本情况；
   (4) 对样地环境进行拍照记录，做好分类标记。
   
2. 蚯蚓采集方法
   根据物种的特性和自然环境现状选择合适的采样方法 (表1)，保证调查的准确性。在野外蚯蚓调查中，主要使用挖掘法、电击法和驱虫剂法 (Valckx et al., 2011; Singh et al., 2016)。具体步骤如下：
   2.1

   挖掘法
   2.1.1 材料与试剂
   自封袋或收纳盒、标签纸、记号笔、橡胶手套、塑料布、塑料保温箱、冰盒等
   2.1.2 仪器设备
   铁锹及其他适合挖土的工具
   2.1.3 操作步骤
   (1) 选取一定面积 (25 cm×25 cm、50 cm×50 cm、1 m×1 m) 和深度 (20 cm或30 cm)，清理表层枯枝落叶、石块等异物，注意其中隐藏的蚯蚓，然后用铁锹按照面积挖掘，将挖出的土壤平铺于塑料布上；
   (2) 穿戴橡胶手套手动采集肉眼可见的所有蚯蚓个体并计数，在计数时以蚯蚓头部数量为准。将蚯蚓装于做好标记的自封袋或收纳盒中，同时装入少量泥土以避免蚯蚓死亡或失活；若天气过于炎热，可将装有蚯蚓的自封袋或收纳盒置于塑料保温箱中，并放冰盒；
   (3) 按照实际情况，可将大面积采样单元分为多个小面积采样单元挖掘，合并计数或者挖掘多个大面积采样单元取平均值后按照面积换算；
   (4) 将采集好的蚯蚓样品尽快送至实验室，进行蚯蚓的标本制作和相关指标测定。
   2.2

   电击法
   2.2.1 材料与试剂
   自封袋或收纳盒、标签纸、记号笔、绝缘手套或塑料镊子
   2.2.2 仪器设备
   地龙仪、铁锹或土钻
   2.2.3 操作步骤
   (1) 取出地龙仪和蓄电池放置在较平坦且干燥的区域；
   (2) 将地龙仪和蓄电池的正负极连接；
   (3) 将输出端正负极分别接至两根电极非绝缘端；
   (4) 再把2根电极按照1 m2对角线插入地面以下30 cm左右；
   (5) 依据地形选择“山地”或“平地”，启动地龙仪，蚯蚓会受电击而向土表移动；
   (6) 用塑料镊子或穿戴绝缘手套及时收集钻出的蚯蚓，并装于自封袋或塑料盒中，注意防止触电；
   (7) 通电大概4~5 min或者观察到再无蚯蚓钻出后，关掉地龙仪电源开关，将电极完全从电池上断开再挪动机器；
   (8) 用铁锹或土钻收集区域附近的土壤，装入含有蚯蚓的自封袋，保证蚯蚓活性；
   (9) 记录完成后，将采集的蚯蚓尽快送至实验室进行标本制作与后续鉴定分析。
   2.3

   驱虫剂法
   驱虫剂法是利用对蚯蚓有刺激性的试剂进行蚯蚓样本采集的一类方法，主要包括福尔马林溶液、异硫氰酸烯丙酯 (AITC) 溶液、芥末悬液、茶枯溶液、洋葱提取液等在内的试剂。考虑到福尔马林对环境具有一定毒害作用，这里建议不用。
   2.3.1 材料与试剂
   (1) 材料：自封袋、标签纸、记号笔、塑料手套等
   (2) 驱虫剂溶液的制备：

   1. 福尔马林溶液：将甲醛溶液稀释至一定浓度，如0.4%或0.5%甲醛溶液；
   2. AITC溶液：取一定体积AITC试剂溶解于丙酮或异丙醇等有机溶剂，在即将使用前用水稀释待用。如制备100 mg/L AITC溶液时，将1 mL AITC溶解在30 mL丙酮中，并用深色容器保存并运至采样地，此时加入10 L水；为防止试剂分离，溶液被搅拌均匀后应立即使用 (Čoja et al., 2008)；
   3. 芥末悬液：取一定干芥末粉于乙酸溶液过夜，再用水稀释至合适浓度。如制备15 mL/L芥末悬液，可将106 g干芥末粉在1 L 5%乙酸溶液中过夜振荡，再按3:200的比例用水稀释摇匀即可 (Chan et al., 2001)；
   4. 茶枯溶液：取一定新鲜茶枯粉，加热煮沸，过滤，再用水稀释滤液至合适浓度。如制备125 mL/L茶枯溶液，将新鲜且细碎的茶枯粉，以质量比1:3兑水，加热回流，沸腾1h，然后冷却过滤；过滤液以容积比1:8兑水，配制成茶枯稀释溶液 (龚鹏博等，2010)；
   5. 洋葱提取液：取一定量的新鲜洋葱放入搅拌机中，加水搅拌打碎，过滤，可适当稀释，得到洋葱提取液。如制备175 g/L洋葱提取液体，将700 g新鲜洋葱与500 mL水加入搅拌机搅碎，过滤，并加水稀释至4 L，得到洋葱提取液(Steffen et al., 2013)。

   2.2.2 操作步骤
   (1) 先选择地表较为平坦的区域，并清理上面明显的枯枝落叶、石块等异物；
   (2) 将一定大小的金属框 (如50×50×20 cm) 插入土壤中5~10 cm；
   (3) 然后将制备好的20~30 L驱虫剂溶液每隔10 min分两次等量倒置在金属框中，使溶液下渗完全；
   (4) 收集所有蚯蚓，直到无蚯蚓钻出，最后将采集的蚯蚓样品送至实验室测定分析。
3. 注意事项
   (1)“野外采集记录”尽可能详细；
   (2) 蚯蚓样品在采集后避免挤压，保持一定湿度和透气性，防止死亡腐烂；
   (3) 提前了解不同采样方法的适用条件或优缺点 (如表1)，根据采样点特征以及采样目的选择合适的方法，注意记录实际采集蚯蚓的面积；
   (4) 在蚯蚓野外采集时，应随时注意自身安全，并提前备好药用物资；
   (5) 采样时尽量减轻对自然环境的干扰，挖掘后需分层回填土壤；
   (6) 建议挖掘法采用小面积，增加挖掘点，采用电击法时要更换采样位置，增加采样次数，避免因蚯蚓分布不均导致的调查无蚯蚓现象；
   (7) 当土壤较干旱时，采用电击法应适当延长电击时间，并结合挖掘法；
   (8) 电击法只用于科学研究，不能用于商业用途；
   (9) 采用驱虫剂法时也可按实际情况设定不同大小的采样面积 (同挖掘法)。
   
   
   
   表1. 不同蚯蚓野外采样方法比较
   

   采样方法	优缺点	注意事项
   挖掘法 (手拣法)	优点：①采集土壤表层蚯蚓的有效性较高，如表栖型(epigeic)和内栖型(endogeic) (Chan and Munro, 2001)；②操作流程简单，易上手；③使用时不受环境条件限制 缺点：①劳动强度大；②耗费时间较长；③破坏土壤结构；④容易造成蚯蚓物理损伤；⑤采集深栖型 (anecic) 蚯蚓有效性较低 (Gunn, 1992)	①在进行采样之前，应根据样地实际环境来选择合适的采样方法；②由于蚯蚓活性与温度和水分关系密切，蚯蚓采样工作需要在合适的土壤温度和水分条件下进行；③建议多种方法结合使用，如挖掘法和驱虫剂法相结合(Bartlett et al., 2008; Pelosi et al., 2009; 范如芹等，2010)，并避免选择对环境污染严重的试剂
   电击法	优点：①收集的蚯蚓个体较为完整；②不破坏土壤结构；③对其他生物无明显毒害作用；④劳动强度低 缺点：①电流过大或电击时间过长，会造成蚯蚓麻痹甚至死亡；②收集的蚯蚓幼体较多，容易低估成体数量，尤其是深栖型蚯蚓 (Čoja et al., 2008)；③易受土壤湿度等环境条件制约 (Zaller &Arnone III, 1999)；④有触电之安全隐患
   驱虫剂法	优点：①收集的蚯蚓个体较为完整；②采集深栖型蚯蚓有效性较高 (Gunn, 1992)；③不破坏土壤结构；④劳动强度低 缺点：①若选择不合适的试剂，如福尔马林溶液，会对蚯蚓和其他生物产生毒害作用，并污染环境 (Eichinger et al., 2003)；②驱虫剂需在室内提前制备，并需注意保存条件及其时效性 (Čoja et al., 2008)；③在野外需要用到大量的驱虫剂溶液，体积较大，携带不便

   
   

三、室内分析工作
室内分析主要进行蚯蚓相关生态指标的测定、蚯蚓标本的制作与保存 (图1) 和蚯蚓标本的鉴定 (图2)。

1. 蚯蚓标本制备与保存
   蚯蚓标本制作参考陈义 (1956) 的方法，结合多年操作经验改进。在标本保存过程中，由于蚯蚓体液、脂肪、色素等会溶于无水乙醇，使得乙醇浓度降低，颜色变深，因此需要及时更换无水乙醇，防止标本腐烂。通常情况下，在蚯蚓标本固定后的一周内，蚯蚓水分、体液、色素等较多，因此乙醇浓度下降较快，且含有较多有色浸出杂质，此时需每1~2天更换无水乙醇，直至无水乙醇澄清透明。在后续保存过程中，由于乙醇挥发及蚯蚓残余水分等原因，需要在后续标本管理中根据无水乙醇颜色和体积及时添加或更换，以保持标本完整良好。
   1.1

   仪器设备与试剂
   (1) 测量工具：电子天平 (精确到0.01g)、直尺 (精确到1mm)等
   (2) 记录工具：签字笔、记号笔、记录本、绘图本
   (3) 固定剂：无水乙醇
   (4) 其他：乳胶或塑料手套、塑料盒、离心管 (50 mL) 或标本瓶、面巾纸等
   1.2

   操作步骤
   (1) 用自来水清洗蚯蚓表面的泥土等杂物，并用面巾纸擦干后称重；
   (2) 用10%的乙醇溶液麻醉蚯蚓；
   (3) 无水乙醇固定10 min，同时拉直蚯蚓身体，方便后续测量和鉴定工作；
   (4) 固定完成后，进行蚯蚓计数和长度测量；
   (5) 将蚯蚓标本装入装有无水乙醇的离心管或标本瓶中，浸没蚓体，盖紧盖子，蚯蚓体积不得超过离心管总体积的2/3，离心管内外均贴好样品标签 (防止乙醇溶解)；
   (6) 蚯蚓标本保存前一周每1~2天更换无水乙醇，保证蚯蚓充分脱水，当保存液基本澄清且无色素析出，即可在室温25℃条件下长期保存，但保存过程中需要做好标本管理。
   1.3

   注意事项：
   (1) 蚯蚓固定时，及时更换无水乙醇，并确保蚯蚓处于伸直状态，便于后续鉴定；
   (2) 测量体长等特征应统一测量时间点 (因蚯蚓固定后体长缩短)，降低操作误差；
   (3) 蚯蚓标本的制作与保存尽量用无水乙醇，既可避免甲醛溶液对人体的毒害，也可以保证蚯蚓组织DNA的提取质量 (Thakuria et al., 2009)。
   
   
   图1. 蚯蚓标本制作与保存
   
   
2. 蚯蚓标本的鉴定
   2.1

   蚯蚓形态鉴定
   2.2.1设备与试剂
   解剖镜、解剖针、手术刀、蜡台、昆虫针、镊子、无水乙醇、记号笔、1.5 mL无菌离心管、蛋白酶等
   2.2.2 操作步骤
   将制作完成的蚯蚓标本用于解剖、鉴定等 (Sims and Easton, 1972)，一般由经验丰富的分类学家进行:
   (1) 将蚯蚓标本从离心管或标本瓶中取出，置于解剖镜下，观察并记录外部特征如受精囊孔、雄孔、乳突和刚毛等的形状、位置、数量等特征，初步鉴定蚯蚓物种；常见蚯蚓物种到这一步即可；
   (2) 用解剖刀 (手术剪) 从蚯蚓第30节开始往前，沿背中线缓慢剖开，用镊子将蚯蚓体表皮向两侧揭开；
   (3) 用昆虫针穿透蚯蚓表皮，将蚯蚓标本固定在蜡台上，固定位置分别位于第4、8、12、16、20、26体节，并用无水乙醇清洗内部组织；
   (4) 将解剖好的样本重新置于解剖镜下，观察并记录心脏、隔膜、砂囊、受精囊等器官的大小、位置、数量和形状等性状，依据形态学和解剖学特征鉴定物种。
   2.2

   蚯蚓分子鉴定
   蚯蚓条形码技术为非专业人士识别物种提供了技术手段。蚯蚓鉴定的分子生物学方法和其他生物类似，具体流程如下：
   (1) 样本准备：根据蚯蚓大小，剪下尾部5~20节 (30 mg左右)，并清洗干净，去除无水乙醇，得到干燥的纯肌肉组织；
   (2) 将准备好的样本剪碎至1.5 mL无菌离心管中，加入蛋白酶等将蚯蚓组织水解；
   (3) 水解完成后，依次加入蛋白质变性剂、无水乙醇混匀，然后转移到带有吸附柱的收集管中静置2 min，离心；
   (4) 离心完成后倒去废液，此时DNA存在于吸附柱，然后用含无水乙醇的漂洗液离心清洗DNA，倒去废液；
   (5) 清洗完成后静置，将吸附柱的无水乙醇晾干，放入新的离心管中，加入洗脱液后离心，此时DNA存在于洗脱液中，可冷冻保存。
   (6) DNA提取完成后用既定引物 (表2) 进行PCR扩增线粒体COⅠ序列 (条形码)，电泳检测后将合格样品测序；
   (7) 获得的序列在NCBI等相关数据库中进行同源性搜索，匹配相似度最高的物种，但同时仍要进行形态学观察确认结果。
   
   表2. COⅠ测序引物序列

   基因	引物	序列	来源
   	LCO1490	GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG	Folmer et al., 1994
   COⅠ	HCO2198	TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA	Folmer et al., 1994
   	COI-E	TATACTTCTGGGTGTCCGAAGAATCA	Bely & Wray, 2004

   
   
   2.3

   注意事项
   (1) 由于传统形态学鉴定特别是土壤生物的物种鉴定需要较高的专业知识，因此需要专业鉴定人员完成；
   (2) 在对比数据库物种信息后，要进行分子和形态特征匹配，必要时进行二次测序，提高鉴定准确率；
   (3) 在未知种鉴定过程中，要将形态学方法与分子生物学方法相结合；
   (4) 建议分子生物学方法鉴定时，使用多个引物进行扩增测序，避免同物种不同序列导致的鉴定结果偏差。
   
   
   图2. 蚯蚓物种鉴定与分析
   
   

四、蚯蚓多样性计算及数据分析
蚯蚓物种多样性是土壤生物多样性的重要组成部分，其多样性大小能够反映其对于外界环境变化的响应程度，被用于评价不同生态系统中蚯蚓群落的多样性和稳定性(Phillips et al., 2021; Li et al., 2021)。通过利用SPSS、R语言等统计软件计算蚯蚓密度、生物量、物种多样性指数 (Magurran and McGill, 2010; Legendre and Legendre, 2012; Legendre and Cáceres, 2013) 和群落的特征加权平均数指数 (Fournier et al., 2012) 等指标，并进行显著性检验，同时采用冗余分析 (RDA) 等手段量化环境因子对蚯蚓群落变化的贡献。最后，综合考虑生物不同模式水平和时空尺度，从多维度进行系统发育、功能性状或不同空间尺度的α、β和γ多样性计算。

1. 蚯蚓物种多样性
   1.1

   蚯蚓密度和生物量
   密度 (Density) = 物种个体总数/采样面积；
   生物量 (Biomass) = 物种总生物量/采样面积。
   1.2

   蚯蚓α多样性指数
   丰富度指数 (Richness)：S，S为群落内的物种数；
   香农-威纳指数 (Shannon-Weiner diversity index) (Shannon, 1948)：H = -ΣP_i(lnP_i);
   辛普森指数 (Simpson diversity index) (Simpson, 1949)：D = 1-ΣP_i²;
   Pielou均匀度指数 (Pielou's evenness index) (Ricotta and Avena, 2003)：E = H/lns;
   Pi为物种i的个体数占总个体数的比例，s为群落内的物种数。
   1.3

   蚯蚓β多样性指数
   (1) 仅考虑物种有无信息
   Jaccard不相似性指数 (Jaccard dissimilarity index) (Jaccard, 1912)：J = b+c/a+b+c；
   Sørensen不相似性指数 (Sørensen dissimilarity index) (Sørenson, 1948)：Sor = b+c/2a+b+c；
   a为两个群落共有的物种数目，b和c分别为两个群落特有的物种数目。
   (2) 考虑物种丰度信息
   Bray-Curtis不相似性指数 (Bray-Curtis dissimilarity index) (Bray and Curtis, 1957)：BCij = 1 - 2*C_ij/S_i+S_j
   C_ij为各物种在群落i和群落j间最小个体数之和，S_i和S_j分别为群落i和群落j的总个体数。
   1.4

   蚯蚓γ多样性指数
   γ多样性：表述区域或大陆尺度整体的多样性，是指区域或大陆尺度的物种数量，也被称之为区域多样性，可指示生境被物种隔离程度，可与β多样性一起构成总体多样性或一定区域内的生物异质性 (李振基, 2014)。
   
2. 蚯蚓功能性状
   群落特征加权平均数指数 (Community-weighted mean trait values)：CWD = ΣP_i×X_i
   Pi代表物种 i 的相对丰度，Xi 代表物种i的性状值，包括蚯蚓的蚓茧数、体长、体宽、生物量、体节数、刚毛数、刚毛类型、受精囊孔和雄孔对数、口前叶类型、体色、生态型、适宜酸碱性、组织碳氮比、氮分泌速率、肠道酶活性等，详见附表2。蚯蚓形态性状如生殖器官数量和类型可在其形态鉴定过程中判断并测定，并根据所鉴定的物种特征识别其生态型及其相关习性 (Bouché, 1972; Bouché, 1977)。蚯蚓组织碳氮比、粘液分泌速率、蛋白含量、肠道酶活等性状指标，有条件下可利用蚯蚓活体并借助传统物理或化学方法进行测定 (Zhang et al., 2000; Zheng et al., 2018)。蚯蚓肠道基因型信息可利用分子生物学技术如高通量测序技术获得。

致谢

本研究由科技部科技基础资源调查专项 (2018FY100300) 和国家自然科学基金项目 (42177286) 资助。感谢中国科学院东北地理与农业生态研究所吴东辉、南京农业大学吴迪、龚鑫、石思博、靳楠、刘喜帅、赵芳、杜彦、焦魁虎、张靖、毛鑫瑞、朱梦一、杨佳妮等在野外采样、室内鉴定和写作过程中的协助。

参考文献

1. 陈义. (1956). 中国蚯蚓. 科学出版社.
2. 范如芹, 张晓平, 梁爱珍, 申艳, 时秀焕, 杨学明. (2010). 蚯蚓野外采样方法评述. 应用生态学报 21(06): 1589-1595.
3. 龚鹏博, 李健雄, 廖崇惠, 张卫信, 郭明昉. (2010). 茶枯溶液在蚯蚓采样中的应用. 四川动物29(03): 401-406.
4. 李振基. (2014). 生态学. 科学出版社.
5. 鲁如坤. (2000). 土壤农业化学分析方法. 中国农业科学技术出版社.
6. 张卫信, 陈迪马, 赵灿灿. (2007). 蚯蚓在生态系统中的作用. 生物多样性 15(02): 142-153.
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