Collection, Preparation and Preservation of Fish Specimens

鱼类常用野外采集工具及相关用品

1. 书面材料：单位公函、项目执行书、捕捞采集证明、租用车辆合同和个人身份证明等
2. 通讯联络设备: 电话 (手机、海上作业卫星电话等)、对讲机、警哨等
3. 采集工具
   1)

   手撒网 (不同网目规格，常采用半目或1目)
   2)

   刺网 (有不同类型的沉刺网和流刺网，网目规格和网片层数亦可不同)
   3)

   定置性张网
   4)

   诱捕器具 (搬罾、地笼)、光诱灯和饵料 (鱼饲料、蚯蚓和自制调和或混合诱饵)
   5)

   小型围网
   6)

   拖网
   7)

   手抄网 (常用网口为正方形)
   8)

   钓具
   9)

   小型便携式电鱼机 (背包式) 或电鱼棍
   10)

   补网工具 (网线和针) 和备用网具 (以备采集过程中网具随水流冲走或沉入水底)
   11)

   标本存放或组织材料存放器具：暂养活体鱼类标本塑料桶或折叠式水箱、便携式充氧泵；存放标本不同规格的标本桶或标本瓶、鱼苗袋；分子盒 (内置1.5 ml离心管，用于存放鱼类组织)、50 ml试管 (用于小个体鱼类整体分子材料储存)；不同规格的密封袋 (用于装组织材料或离心管)；液氮或干冰罐和冰盒等保冷设备 (用于肝脏等组织保存)
   12)

   其他相关用品：望远镜、指南针、照亮工具 (头灯、打火机、强光灯或手电筒) 等；洞穴采集还需包括安全头盔、绳索和攀爬工具等；滩涂采集减少压力防止下陷的特殊装置 (跪式滑板或翻耕) 等
4. 记录工具
   1)

   野外采集记录本、预先打印好的测量表、防水标签纸、记号笔、铅笔等文具
   2)

   标本或生境拍照设备：单反 (带微距镜头) 或手机、小型拍照缸 (长30-60 cm，玻璃制)、造景材料 (底沙或砾石，可野外就地取材)、毛巾、深色背景板和能显示标本大小的识别尺度的测量工具 (直尺) 和物品 (硬币) 等，如有需要还应配置小型摄影棚 (用于夜晚拍摄)
   3)

   环境或生境记录设备：GPS (测定经纬度和海拔)、水质分析仪 (测定水温、溶氧量、PH值和电导率等水文参数) 和鱼探仪 (常用于湖泊和海洋鱼类采集)
5. 测量及解剖工具
   1)

   量鱼板 (1-1.5 m)、直尺 (20 cm、30 cm或60 cm) 或游标卡尺 (150-300 mm)，电子天平 (常用量程500-2500 g；根据鱼体大小精确至0.01或0.1 g)
   2)

   解剖器具 (解剖盘、塑料或不锈钢托盘、不同规格的手术剪或解剖刀和镊子等)、注射器及备用针头、培养皿、量筒、口罩、一次性橡胶手套、棉线、医用缝合针或标签枪、防水的打码标签布 (已用打码机标号)；医用纱布、吸水纸；钢丝 (固定骨骼标本)、化纤棉等填充物 (用于皮制标本)、昆虫针和泡沫板 (用于固定鳍条) 等
6. 个人野外采集装备及药品
   1)

   野外采集装备：下水裤、长筒雨鞋、救生衣、遮阳帽、户外防寒遮雨装置 (冲锋衣和雨衣) 等
   2)

   药品：个人防晒驱蚊、虫、蛇等物品 (风油精、花露水和季徳胜蛇药等)，外伤简单处理药品 (创口贴、酒精棉球、纱布、绑带、红药水和伤膏等)，感冒药、腹泻药、止疼药和消炎药、过敏药等

常用标本制作药品

1. 固定液、保存液和防腐剂：常用为5%-10%福尔马林 (甲醛溶液和水按照1:19或1:9比例混合制成) 和酒精 (浓度99%以上纯乙醇和75%乙醇) 等
2. 麻醉剂：用于活体标本麻醉便于固定，常用乙醚和丁香油 (牙科医用)
3. 漂白溶液：2%-3%双氧水 (H₂O₂) 或0.5%-0.8%过氧化钠溶液 (Na₂O₂)
4. 剥制制作药品：75%-95%酒精；明矾 (十二水硫酸铝钾)、食盐和水按照1:2:10配制的剥制浸泡溶液
5. 干制 (骨骼) 制作药品：汽油、95%以上乙醇、0.5%-0.8%氢氧化钠溶液 (NaOH) 或氢氧化钾 (KOH) 溶液
6. 透明骨骼制作药品：11%-3%氢氧化钾 (KOH) 溶液、30%饱和硼酸 (H₃BO₃) 溶液胰蛋白酶、冰醋酸 (CH₃COOH)、阿利新蓝 (Alcian Blue 8GX) 染色、茜素红 (Mordant Red 3) 乙醇液 (茜素饱和溶液与70%的酒精按1:9配置)、95%的乙醇、甘油 (30%、70%、100%)
   注：3-6提及的药品通常为采集后实验室标本制作的药品
   

标本野外采集与制作步骤

一、采集前准备工作

1. 采集前首先明确采集地区 (流域) 的范围和收集本底资料。收集该地区或流域以往文献和调查资料，以便了解拟采地区所分布的鱼类种类和相关环境资料，如水系、地形地貌、水文条件和交通状况等，同时了解拟采地区的地方法律法规、禁渔期和禁捕区、特殊区域 (如西藏地区) 少数民族的特殊风俗习惯等信息。
2. 采集前需提前联系中华人民共和国农业农村部渔政局或下属各省级主管部门，并办理捕捞许可等相关手续，尤其是采集列入国家重点保护名录的鱼类，必须得到相关部门的特殊批准。另外，正式采集前仍需提前与地方相关行政管理部门取得联系，以求得到当地主管部门的支持和协助。如果非个人采集，还需获取所在单位的介绍信或工作接洽函以便后续工作的开展。
3. 出发前制定较为合理的野外采集计划，包括行程路线、日期和采集目标、采集量等。一是为后续能快速开展工作；二是使让当地主管部门了解野外调查计划，便于协助。
4. 根据拟采地区水环境、地形、潮汐和天气的状况，准备相适合的采集工具、野外调查装备及个人必需用品和药物等；提前办理好必要的相关证明材料、出差手续、人身保险和疫苗注射 (如果进入疫区采集)；知晓在采集过程中可能会面对的突发自然灾害及应对方法。对于高原、滩涂和地下洞穴等特殊环境采集，则应进行适应性训练或雇请当地有经验的渔民或村民做向导，并参与实际采集工作。
   

二、标本采集基本方法和过程

1. 标本直接采集
   在采集地采集前和过程中，应随时注意气候变化、水位变化及周边环境情况。在保证人身安全的情况下，根据不同水体环境采用相适合的、较为有效的捕捞工具，至少两人协同采集。具体捕捞工具选择和使用情况如下：
   1.1

   手撒 (抛) 网
   手撒 (抛) 网是一种单人即可操作的比较有效的简单传统渔具，主要有传统手抛网和美式飞盘撒网 (比传统手抛网易操作) 两类。一般水深1 m以上且水流较平缓的内陆水域和沿海平缓浅湾均适合使用，避免在石头、水草和树枝过多的水域中使用。传统撒网通常选用网眼为1指，高2-5 m，直径达4-8 m，绳长8-10 m的手撒 (抛) 网，在岸边或渔船上，采用两把撒法或拐把法 (适合浅水区，易于新手操作) 将网具抛出，网口尽量成圆形，自上而下掩罩住鱼类 (孙满昌，2005；伍玉明，2010)。
           两把撒法：(1) 首先将与抛网相连的绳子理顺，卷成一个个小圈，抓在手里 (常用左手)；(2) 继续把抛网上段盘成一个个小圈约至网长一半处 (最后一圈实为半圈，剩余的网高与头部齐平)，抓在手心；(3) 理网，将坠子均匀抖开，避免坠子缠绕，抖开后提网往里集中，以免铺的过开不利于后面捡网；(4) 左手把网拉高、撑直，右手从下面 (膝盖相对位置) 拎起2-3个网兜，放置左手里；(5) 右手虎口夹住与膝盖齐平的底纲绳，斜上方45 °往上捡网，捡至剩2-3个网兜；(6) 捡完后，左手从右手夹的网兜中抓几个兜 (一般右手抓三分之二网兜，左手抓三分之一网兜)；(7) 左、右手拎起网，自身体左侧右旋用右手撒出，顺势送出左手的网口。
           拐把法：首先整理好网 (同两把撒法前三步)，提起最左侧的网兜，离网口约50 cm处挂在左肘上，左手平端握住1/3网口，然后，右手连同坠子握住1/3多的网兜，撒网时依次抛出右手、左肘和左手上的网兜。
           手撒 (抛) 网撒出后，静待坠子下沉几分钟或沉底后，再缓慢收拢网衣，将网具拉至船上或岸边，从网兜中小心取鱼，以免鱼体鳞片掉落。
   
   
   图1. 手抛网 A. 美式飞盘撒网 (赵耀 摄)；B. 传统手抛网 (武云飞先生在云南省南腊河采集鱼类，张洁 摄)
   
   
   1.2

   刺网
   刺网又称挂网，是一种以网目刺挂或网衣缠绕鱼类的方法作业，且适用于多类型水体的网具 (刘松岩，2013)。按水域作业方式，可分为漂流刺网、底层刺网、定置刺网和表层刺网等；按照结构特征主要有单层 (片) 刺网、多重刺网 (含三重 (蟹) 刺网，通常被用于捕捞螃蟹、虾类)、围刺网和拖刺网四种，其中单刺网和三重刺网较为常见，主要区别在于三重网刺比单刺网多两片网衣，二、三片网衣的网目越来越小 (沈长春等，2018；王长工，1991；杨吝，2017；赵乃刚和沈菊人，1990)。
           根据采集对象的活动水层和大小，采用不同类型的刺网和不同规格的网目尺寸。由于刺网作业方式比较机动灵活，不受水深和底质限制，所以使用范围比较广泛，但该网具对渔获物的大小有一定选择性 (网目不得小于《中华人民共和国渔业法》规定的最小网目尺寸)，且非常容易造成鱼体部位损伤和渔网的破损 (上海水产学院主编，1983；伍玉明，2010)。
   
   表1. 不同类型刺网的差异
   
   
   
   图2. 刺网 A. 定置刺网 (张洁 摄)；B. 流刺网 (张洁 摄)；C. 流刺网示意图 (引自上海水产学院主编，1983)
   
   
   1.3

   定置网具
   定置网具是一种在内陆水域和沿海捕捞生产中使用范围广泛的重要捕鱼工具之一，是一类被动性的捕鱼网具。该类网具使用方式是在一定的季节或时间内把网具对着水流方向敷设或拦截鱼类通道敷设，依靠流水冲击或网具的升导装置，诱导鱼群陷身入网或利用水流压入囊网。定置网具大致可以分别为插网类、迷魂阵类、张网类和建网类4种类型 (四川省水产学校主编，1980)。在淡水鱼类野外采集过程中，常在溪流或缓流使用一些非违禁、小型便携式张网类网具。
           另外采集鱼类早期资源样本，如鱼卵和幼鱼，常会采用长条形的定置早期资源网。
   
   
   图3. 定置网具 A. 小型竹笼；B. 大型竹排 (秦涛 摄)；C. 张网类 (在拦截上游随激流冲来的渔获物，张洁 摄)
   
   
   图4. 早期资源网 (付贵权 摄)
   
   
   1.4

   诱捕器具
   诱捕器具是一类在定置网具的基础上，通过器内放置饵料或利用鱼类趋光性引诱捕捞鱼类的固定式渔具 (伍玉明，2010)。野外采集常用的诱捕器具为地笼。
           地笼种类、规格多样，常见有长条型地笼和伞型地笼，适合江河、湖泊、水库、池塘、小溪、浅海水域等水流较缓处或静水环境使用 (洞穴鱼类采集尤为常用)，主要以捕捞小型鱼类为主。通常地笼放置时间较长，捕捞效率较慢，一般傍晚放置第二天取或根据采集安排2-6 h后取出 (伍玉明，2010)。
   
   
   图5. 地笼 A. 长条型地笼 (林峰 摄)；B. 伞型地笼 (洞穴环境下放置，周佳俊 摄)
   
           提 (搬) 罾是一种小型用木棍或竹竿做支架的方形定置网具，常用于湖泊、水库和缓流水体捕捞鱼虾 (刘松岩，2013)。一般在其网片中间放一些饵料 (鱼饲料或玉米等杂粮调和的面团)，置于水中，一段时间后抬出水面，以此捕获鱼类，也可在夜间附加光诱灯 (卤素灯，氙气灯，LED灯，光色以黄蓝为宜，55-600 W) 诱捕鱼类。野外多使用与其原理相似的挑网，以捕捞小型鱼类为主，但捕捞量较小。
   
   
   图6. 提 (搬) 罾 A. 河道中的提 (搬) 罾 (林峰 摄)；B. 水库中的提 (搬) 罾 (张洁 摄)；C. 挑网 (林峰 摄)
   
   
   1.5

   小型围网
   小型围网适合于浅滩、水流平缓处使用 (薛大勇，2010)。出于便携和实用性考虑，野外淡水和沿海浅滩鱼类采集使用2-8 m长、1-1.5 m深、网眼尺寸10-40 mm的小型围网较为合适。大中型围网常用于渔船在海洋或江河湖泊捕捞深水水域的表层鱼类。
   
   
   图7. 围网 A. 河流小型围网；B. 湖泊大型围网 (陈小勇 摄)
   
   
   1.6

   钓具
   钓具是垂钓和延绳钓作业方式中重要的工具，主要分为竿钓、手钓、拖钓、立式延绳钓和卧式延绳钓5类 (杨吝，2017)。
           在各水体采集鱼类标本，利用钓鱼竿 (由钓竿和单丝线组成) 也是一种常见的方法。由于饵料的不同，垂钓对采集的鱼种具有选择性。垂钓通常比较耗时，同时采集人员需具备一定垂钓的技巧和经验，所以仅在捕捞特定鱼种时使用 (伍玉明，2010)。
           延绳钓是一种在海洋和内陆水域广泛使用的钓具，其基本结构包括钩线 (主线和系有若干支线)、钓钩和浮标、沉子装置，具有分布面广、产量高等特点 (李伟和宁君，2017)。采集人可以在不同规格的鱼钩放置不同诱饵，然后通过利用浮标、沉子以及浮标绳子的长度和沉降力的配备调节深度，捕获所需水层的鱼类 (李伟和宁君，2017；伍玉明，2010)。
   
   
   图8. 垂钓 A. 江河垂钓 (林峰 摄)；B. 溪流垂钓 (孙志贤 摄)
   
   
   图9. 各类延绳钓 (引自联合国FAO网站http://www.fao.org/fishery/geartype/109/en)
   
   
   1.7

   小型便携式电鱼机 (背包式)
   电捕鱼是一种对鱼类个体大小和物种种类非选择性的渔法，适用于鱼类丰富度的调查，大部分淡水环境和沿海浅滩均适用。电捕法对鱼类是非选择性捕获，对幼鱼和繁殖期的鱼苗会致死，因此野外采集一般采用低电压 (12 V，鱼类只致晕不致死，且保障采集人员安全) 的小型便携式电鱼设备。采样操作时，应注意防护，穿戴橡胶防水裤、橡胶手套，手抄网的手柄也最好采用木质或绝缘材料.。
           目前电捕 (鱼) 在国内及国外一些地区被列为非法行为并列入刑罚，因此采用该捕捞方式前，必须向当地相关部门报备，获得审批后方可使用。近年来，随着我国对鱼类资源保护的重视程度提升，科研上采取电捕法也有所限制且不值得提倡，建议可采用多种工具、多次采集的方式减少采样选择性的影响，从而取代电捕法的使用。
   
   1.8

   手抄网
   手抄网常作为一种辅助渔具，可采用捞或铲等方式在浅水、缓流或静水环境下采集中上层和底栖小型鱼类 (伍玉明，2010)。手抄网类型多种，根据网袋形状可分为三角形、长方形、正方形和圆形等；野外采集常采用网口大小为30-60 cm，网目0.5-1.0 cm的手抄网。
   
   
   图10. 手抄网 A. 长方形网袋的手抄网 (秦涛 摄)；B. 三角形网袋的手抄网 (林峰 摄)
   
   
   图11. 电鱼机和手抄网相配合捞取渔获物 (渔政人员监督下 张洁 摄)
   
   
   1.9

   拖网
   拖网是一种由2个以上网袖组成的锥袋形网具，主要有底拖网、对拖网和桁拖网3类 (杨吝，2017)。拖网作业为由1至2艘渔船在海洋或江河拖拽，迫使在网口作用范围内的水生生物进入网内，具有捕捞范围广、效率高、灵活机动性强、通过调节渔网浮子和沉子的配置可作业于不同水层、渔获物种类多样等特点 (李显森，2017；刘松岩，2013)，在拖网作业过程中，缆绳的张力需要随时观测，以防缆绳或网具在作业过程中脱落。
   
   
   图12. 拖网 A. 南大洋极地科考中水层鱼类拖网作业I-放网； B. 南大洋极地科考中水层鱼类拖网作业II-拖曳 (张洁 摄)
   
   
   1.10

   其他形式
   滩涂采集为了防止深陷泥潭，采集者往往单腿跪在一种叫做"泥马"的器具上滑行，抛出鱼竿前端的四齿鱼钩，精准地将鱼勾住并慢慢拉回；亦或利用弹涂鱼受到惊吓跑回洞穴的习性，在滩涂上插放竹制或塑料制的圆筒状陷阱，定期取回陷阱中的渔获物。另外，鱼叉、鱼枪在捕获溪流或珊瑚礁鱼类也较为常用。
   
   
   图13. 其他捕鱼方式 A. 滩涂上捕获弹涂鱼 (张洁 摄)；B. 东南亚地区溪流鱼枪作业 (舒树森 摄)
   
           不管采取哪种采集工具，应根据采集地环境选择适宜、高效的渔具渔法，也可多种工具相结合以达到采集目的。
   
2. 聘请当地渔民或专业人员协助采集
   在一些淡水水域状况复杂地区，尤其是对该地区水环境并不熟悉的情况下，可以雇请当地渔民或居民协助进行标本采集。海洋鱼类采集可以跟随渔船或科学考察船，根据采集目标，采用不同网具 (流刺网、拖网、鱼叉、钓竿等) 进行采集。未经过专业洞穴探险训练人员，洞穴采集最好请洞穴探险专业人员和熟悉洞穴环境人员随行陪同，并携带好必要的采集工具。
   
3. 市场或水产码头购买
   通过当地的农贸市场、鱼市场或水产码头，根据需求购买、收集鱼类样本，购买同时应询问其捕捞的详细时间、地点和方式，以及是否为养殖品种，避免购买到非本地鱼类。
           通过上述方法收集到的鱼类标本，应尽快带回室内予以测量、解剖、取材、固定等处理。活体鱼类需暂养在放置氧气泵的容器内，用于后续活体拍照或取材；若非特殊要求，采集到一定数量的鱼类标本后，多余个体应予以放生。
   

三、野外标本处理

1. 野外采集记录
   野外记录采集地的相关信息对日后研究工作十分重要。因此在开始采集前，应先使用GPS、水质分析仪等设备对相关参数进行测定，然后用记录表 (本) 记录采集地地理信息及其生境信息，包括采集时间、地点、河流名 (水系)、经纬度、海拔、水质信息 (pH、水温、溶氧量、水体颜色、透明度等)、周边植被覆盖情况和干扰类型等 (表2)，最好使用照相设备对采集地的生态环境和周边生境拍照记录，方便后期工作。
           标本采集结束后，及时在野外对所采集到的鱼类标本进行初步鉴定，根据研究目标，筛选研究对象并记录；根据采集实际进展，选择当场或回到驻地对标本拍照、生物学测量、分子材料采取、打标签和标本固定等后续工作。
   
   表2. 野外生境记录表
   
   
   
2. 拍照与测量
   2.1

   拍照
   野外采集到标本后，应在标本固定防腐处理和体色褪去前，及时使用单反相机 (单反镜头可以选用尼康AF-S VR 105 mm f/2.8G IF-ED；佳能 EF 100 mm f/2.8L IS USM；腾龙SP 90 mm F/2.8 Di MACRO 1:1 VC USD等微距镜头)、微单数码照相机 (如索尼A7全画幅系列) 或智能手机等图像采集设备对新鲜标本采集图像，记录标本活体颜色。野外拍摄鱼类标本一般拍摄标本照和活体照两种类型 (薛大勇，2010)。
           活体标本拍照应选择个体适中、体态较好、体表色彩鲜明且真实的鱼类标本，放入小型水族箱或玻璃缸内拍摄。拍照时应尽量选择白天自然光充足的环境下。为得到高质量照片，可考虑在水族箱或玻璃缸内模拟拍照对象的生活环境，或用与标本体色色差较大 (黑色、深蓝色较为合适)、反光性差的衬板作为背景。夜间可采用小型摄影棚拍照，拍照前需色调校对。
   已死亡或固定的鱼类标本，将其放在色差较大且不反光的塑料或橡胶衬板上拍摄。拍照时，将标本各鳍条尽量充分展开，一般采用头朝左的侧面照，对一些特定体型鱼类可同时拍摄其背面和腹面。此外，尽可能也对鱼类标本具有分类学意义的其他特征拍摄，以便于后续的比对鉴定。
           无论那种类型的鱼类照片，下方应放有刻度尺或常见标识物如硬币，以显示标本大小。另外为防止拍照时自来水中的气泡附着于鱼体，干扰成像效果，缸内水最好采用河水、海水、纯净水或经曝气后的自来水。
           完成拍照后，还应将拍照的鱼种名称、照片编号对应记录在案。图片可适当修图，以达到更好的效果。
   
   
   图14. 标本拍照 A. 活体麻醉后标本拍照；B. 活体缸照 (A、B为冯新明 摄)；C. 死亡鱼类标本放置标识物拍照；D. 浸泡保存液后标本拍摄；E. 死亡鱼类标本浸水拍照；F. 夜间小型便携式Travor F4O摄影棚拍摄活体缸照 (C、D、E、F均为林峰 摄)
   
   
   2.2

   鱼体基础生物学参数测量
   对所采集的未浸泡固定液的鱼类标本生物学参数测量首先把电子秤、鱼板或直尺 (游标卡尺) 等测量工具、解剖盘 (白瓷盘) 等工具和鱼类野外样本采集记录表 (表3) 放置在清洁的工作台上；然后带上一次性橡胶 (乳胶) 手套，将丁香油 (麻醉剂) 滴入 (2-3滴即可) 放有活鱼的水中，混匀，待活鱼麻醉后从塑料桶中取出放在电子天平上 (非活体鱼类样本可直接放到电子天平上，不必使用麻醉剂)，记录重量读数；接着将鱼侧放在量鱼板或内有直尺放置的白瓷盘上测量长度 (也可以手持游标卡尺测量) 并记录，测量时注意对齐鱼体但不覆盖刻度。常见生物学参数包括体长、全长、体重、空壳重、性腺重、肝脏重等，具体定义及测定方法不在本文中详细叙述。
   
   
   图15. 标本测量与称重 A. 游标卡尺测量；B. 直尺测量；C. 软骨鱼类的测量 (王宽 摄)；D. 鱼类电子秤称重 (A、B、D为林峰 摄)
   
   
3. 组织材料采取
   为后续进一步深入研究，一般对所采集到的鱼类样本进行固定和组织材料的二次取样，按用途大致分为两类：分子实验材料和生物学研究材料。
   3.1

   分子实验材料采取方法
   野外常采取的分子实验材料通常为鱼类偶鳍 (常为鱼体右侧的腹鳍或胸鳍)，或在鱼体右侧面侧线以上背鳍基部左下方的肌肉，用于DNA提取。主要步骤为：采集人员带上一次性橡胶手套后，先用火焰灼烧酒精清洗过的剪刀前段，等其冷却后剪取标本的鳍条或肌肉组织；然后用酒精清洗过的镊子将其放入事先准备好的1.5 ml离心管 (内含标签号和95%以上乙醇)，拧上试管盖放入冻存盒中；在取下一份分子组织材料前仍需重复清洗工具过程，以免交叉污染。大个体鱼类的分子材料可取少量，满足被保存液能完全浸泡即可；太小个体标本视情况需多采取几个组织部位或整体直接放入装有95%以上乙醇溶液的离心管中。
           获取转录组实验的材料时，一般先用解剖刀或剪刀结合镊子将已麻醉或刚处死不久的鱼类标本的必要组织，如鳃、脑、心脏、肝脏等快速取出 (过小个体鱼类可整体) 放入预冷的冻存管中，随后将其放入小型液氮罐、-80 °C冷冻冰箱或干冰中 (暂时保存)，全部过程在严格的无菌条件下并置于干冰或冰块上操作。如果采用RNA later^TM动物组织RNA稳定保存液保存新鲜组织样品，请参见其详细使用说明书，需注意使用量、保存方法和保存周期。
           获取的分子实验材料应及时放入-80 °C超低温冰箱中长期保存。
   
   3.2

   生物学研究材料取样方法
   生物学研究材料主要包括用于年龄鉴定材料 (鳞片、耳石、脊椎骨等)、性腺材料 (精、卵巢) 和食性材料 (胃内容物、肠胃等)。用于常规分析或切片的性腺组织和胃内容物观察，一般需用5%-10%甲醛溶液进行固定，后装入相应大小的标本瓶或试管。
           鳞片采取主要是用镊子将有鳞鱼类标本背鳍起点下方侧线以上的一排鳞片取出，然后用清水清洗干净，再用纱布或吸水纸沾去过多水分后放入密封袋或夹入纸夹本里，最后在外面标注物种名称、采集地、采集时间、采集标号等相关信息。
           鱼类耳石是研究鱼类学或鱼类栖息地环境的重要研究材料。鱼类的耳石较小，位于大脑后下方，易与头部的有机组织和杂质混淆，因此摘取耳石的过程比较复杂、费时。耳石的摘取通常采用解剖工具从头部顶端沿鳃盖边缘或眼后缘约一眼径距离斜下方将头盖骨剖开，使得大脑暴露，小心将其剥离，用镊子取出耳石 (如果耳石太小，可在解剖境下操作)；所得到的耳石用蒸馏水清洗，去除表面的外包膜和黏液，用吸水纸吸干表面水分后放入有编号的1.5 ml 离心管中保存，用于后续观察 (熊瑛等，2018)。不同个体大小、不同体型的鱼类也有一些快速摘取耳石的方法，比如鱼体长度小于20 mm，可通过在次氯酸钠溶液中浸泡3-5 min，从而融化鱼头暴露耳石，再用镊子从中挑出耳石 (Secor et al., 1992)。更为详细的操作，请参考公共资料手册：http://fishconnectivity.c bl.umces.edu/research/otolithmanual。
           采集过组织材料的标本最后还需编号，如果单人野外工作，尽量每一次采集操作后，就将对应的标本编号。一般采用以下几种方法：

   1)

   用标签枪将带有编号的塑料标签射入鱼体尾柄或下颌处。

   2)

   将已编号的防水纸或布裁剪成适宜大小塞进鱼体非完整一侧的鳃盖中 (一般为右侧)。

   3)

   用医用缝合针和棉线将标签布穿系在鱼体非完整一侧的尾柄上 (不必对穿)
   
   
   图16. 生物学组织采取 A. 采取分子实验材料 (冯新明 摄)；B. 采取生物学材料 (林峰 摄)
   
   
4. 野外标本固定、保存
   鱼类标本在使用固定防腐液固定保存之前，需对标本打野外采集标签 (具体方法见3. 组织材料采取)。由于野外采集工作繁重、时间紧迫，一般只对采集过组织材料或拍照的标本打野外标签，其余皆回到实验室或标本库分类鉴定后进行编号工作。
   野外标本固定、保存步骤如下 (冯恩慧和陈炜，1998；伍玉明，2010；周伟等，2021)：
   4.1

   准备好固定液 (10%的福尔马林溶液或95%以上的酒精溶液) 和保存液 (5%的福尔马林溶液或75%以上的酒精溶液)，各种规格、密封性良好的塑料标本瓶 (或鱼苗袋，用于大型鱼类) 和防水标签等相关材料和药品。
   4.2

   将采集到的鱼类标本从头至尾方向轻轻清洗干净，以免易掉鳞鱼类鳞片脱落。
   4.3

   将已麻醉的或死亡不久的鱼类标本整形、归拢鳍条，头朝下垂直放入标本瓶中 (活体标本可以直接放入，不需要整理，切记勿在水中过久饲养，死亡后形态易发生变形)；较大个体鱼类标本在放入标本瓶前，还需在其体内或腹腔注入10%的福尔马林溶液，注入量约为每千克重/10 ml，或者至腹部微隆起，以免内部组织腐烂。对于鳍条舒展状态不好的标本，需将其侧放在泡沫板或平板上，用昆虫针或具防护的手固定住各部位鳍条，然后用注射器将固定液 (10%福尔马林溶液) 滴在鳍条表面，保持至鱼鳍不再回缩为止。
   4.4

   将固定液缓慢倒入倾斜的标本瓶中，使得标本被液体完全浸没；然后将记录有相关采集信息的防水标签放入其中，拧紧密封盖。
   4.5

   平放标本瓶，观察标本是否完全浸没，形体是否有弯曲。由于福尔马林液体具有挥发性和刺激性、对人体有害，还需将标本瓶平放入较大的塑料桶中 (50-100 L) 或密封性较好的大型容器中。
   4.6

   一般固定液浸泡固定1-2 d后，直至鱼体完全僵硬，就可以替换成5%的福尔马林保存液长期保存，保存液仍需完全没过鱼类标本。
           使用酒精固定液保存标本的方法与福尔马林固定液步骤相似，但中途需更换固定液的次数较多，第一天一般更换2-3次，样本间隔浸泡1-2 h或浸泡液体呈黄色就需及时更换，后期可延长更换时间减少次数。3-5 d后，当标本完全僵直，可替换成75%酒精保存液实现中长期保存。
           另外对于鱼卵、幼鱼或深海鱼类等应采用低浓度固定液 (4%福尔马林或70%酒精) 保存，而体型呈长条形鱼类如鳗鲡目可使用丙醇溶液进行固定保存 (伍玉明，2010)。
   
   
   图17. 野外鱼类标本放入标本瓶保存 (林峰 摄)
   
   完成上述一系列工作后应及时将测量数据、图像信息、样本野外标签号、野外标签号等相关信息整理到鱼类野外采集记录表 (表3) 或记录本中，并检查相关信息是否一致。
   
   表3. 鱼类野外样本采集记录表
   
   
   

四、标本制作

鱼类标本类型较多，主要包括浸制标本、剥制标本、干制 (骨骼) 标本和透明标本。浸制标本是将鱼类整体或部分部位直接放入各种化学药品固定保存的一类标本；剥制标本是指通过各种方法保留鱼皮并将其填充各种材料恢复至原有状态的标本；骨骼标本是指将鱼类整体或部分 (主要为头部) 经过各种方法剔除鱼类内脏、肌肉等组织仅保留骨骼，并通过化学药品去脂、漂白并将骨骼整形串联的一类标本 (伍玉明，2010)。透明骨骼标本是指小型鱼类经过化学药品脱脂、透明和染色后，可被清晰观察其硬骨和软骨组织。这些标本所采用制作的方法有所不同。

1. 浸制标本制作
   鱼类整体浸制标本具体步骤见“4. 野外标本固定、保存”。鱼类解剖标本是用于显示鱼类内脏结构的一类标本，但鱼类这类标本很少制作。基本步骤为用剪刀剖开侧面体壁暴露出内部结构 (或单独将某器官浸制)，将标本或器官然后放入固定液中 (10%福尔马林溶液)，多次置换溶液直至固定，然后放入5%福尔马林溶液 (或与甘油混合液) 再固定2-3周，最后放入有保存液的玻璃标本瓶中，用凡士林或石蜡密封，防止固定液挥发或泄露。外贴相关信息标签 (李典友和高本刚，2016)。
   
   
   图18. 浸制标本保存 A. 软骨鱼浸泡标本；B. 硬骨鱼浸泡标本 (张洁 摄)
   
   
2. 剥制标本制作
   剥制法一般适用于体形较大且皮肤和鳞片完整的鱼类，如鲨鱼、鳐类、鲤鱼。剥制标本制作技术复杂，基本过程如下 (参考李典友和高本刚，2016；武汉大学和南京大学，1978；伍玉明，2010；郑伟，2009；周伟等，2021)：
   2.1

   预处理，先用干布或纱布将鱼体表面小心擦干，以免鳞片脱落。
   2.2

   测量与摄影：记录鱼类形态特征及测量性状，并对整体和局部形态拍照，作为标本资料及整形时比较参照。
   2.3

   剥皮：用解剖工具从鱼类腹面中线剖开，小心剔除脂肪、肌肉、骨骼，期间注意保持鳞片、鳍条及皮肤的完整性。
   2.4

   浸皮：浸皮是为了去除残留的肌肉和脂肪组织。小型鱼类用 75%-95%酒精浸泡1-3 d；大型鱼类用明矾、食盐和水按照1:2:10配制的溶液浸泡5-10 d。浸皮过程中需时常间隔数小时进行翻动，并在鱼皮上涂抹适量甘油，以保证鱼皮不易发生变形，几天后取出用水清洗。
   2.5

   装填、固定：使用钢丝、竹、棍和塑料泡沫等做假体支撑材料，做成的假体大小应与鱼体相适合，然后采用化纤棉及聚乙烯等不易腐烂的材料填充入鱼皮内，最后将标本固定在底板上。
   2.6

   缝合切口，涂防腐剂：标本装架完成后，清洁干净标本；缝合切口，然后涂抹石蜡，对比照片用颜料着色后，再在鱼体表面刷一层清漆松香水，防止鱼体褪色，起到保护作用。适量加入防腐剂，一般使用常见的樟脑和明矾等。
   2.7

   整形：对剥制标本整形，采用玻璃球或色泽近似的塑料球制作的义眼充当剥离的鱼眼；掉落的鳞片用乳胶粘补；未充分展开的鱼鳍则采用硬纸板和回形针将鳍条夹好固定，等自然风干完全成型后再拆除辅助材料。
   
   
   图19. 河豚鱼的剥制标本 (张洁 摄)
   
   
3. 骨骼标本制作
   应选择新鲜完整、骨骼硬化好、个体稍大的鱼类标本用于制作骨骼标本。经过处死后，制作具体实施步骤如下 (参考曹天玲等，2018；李典友和高本刚，2016；苏怀栋等，2012；薛大勇，2010；肖方，1999；伍玉明，2010；周伟等，2021)：
   3.1

   除去鳞片、皮肤：鳞片比较发达的鱼类 (如鲤鱼、鲫鱼等) 应先刮鳞片；鳞片不发达或没有鳞片的鱼类 (如鲇类、鲈形目中的某些鱼类等) 可直接去皮肤。
   3.2

   除去内脏和眼球：将去鳞片或去除皮肤的标本从两胸鳍间向后剖开腹腔，轻轻将内脏等内含物去除；将头部的眼球、眼肌、颊部等肌肉取出。注意不要破坏鱼的骨骼结构。
   3.3

   剔除肌肉：一般先用解剖刀分别从头部向后沿背脊两侧纵行剖开，之后从背鳍下方顺着腹面肋骨，用解剖刀平向削去肋骨表面的肌肉，待肋骨露出后仔细分离其间肌肉。等脊柱、肋骨表面肌肉粗剔完后，用手按住鳍条基部，刮去其肌肉。脊椎骨、肋骨、肩带、各鳍条等有肌肉或韧带组连接或者愈合，因此应避免损坏韧带，防止关节分离，可适当保留一些肌肉。然后进一步精细剔除肌肉，后续还可用水煮或腐蚀 (氢氧化钠溶液浸泡12-24 h) 等辅助手段将肌肉剔除干净。
   3.4

   脱脂处理：将剔除肌肉的骨骼浸泡于适量的汽油、95%以上乙醇、0.5%-0.8%氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液等溶解脂肪，等完全去脂后取出清洗。脱脂处理过程中需要经常观察，避免过度浸泡造成各关节间分离。标本一般需要浸泡1-6 d，具体时间需参考采用的溶剂、鱼类大小和季节温度等。
   3.5

   漂白：将脱脂处理过的骨骼标本浸入2%-3%过氧化氢溶液或0.5%-0.8%过氧化钠溶液等漂白剂中，待骨骼洁白后及时将标本取出，并立即用清水洗净。期间需经常观察标本的变化，漂白时间大约需要1-4 d。
   3.6

   整形串装：将标本在阳光下晾晒，自然风干，注意晾晒过程中为避免各部分鳍条弯曲，可用厚纸将它们包起来并压紧。待骨骼基本干燥后，将头骨、躯体和各鳍条的姿态进行整形处理并按骨骼  相应的位置用大头针、钢丝或棉线固定，离散的骨骼可用白乳胶或鞋胶将其粘接，以免在二次干燥过程中变形。
           整个处理过程完之后，将制作好的鱼类骨骼标本根据大小分别装入特别制作的保存盒中或用支架固定。
   
   
   图20. 鳕鱼的骨骼标本 (张洁 摄)
   
   
4. 透明标本制作
   鱼类透明标本，一般选择体长10 cm以下的鱼类制作效果较好。透明标本制作是应用化学药品和物理方法使肌肉透明、骨骼着色从而显示出生物体的骨骼发育情况 (刘万祥等，2002)。通过透明标本，可直观地观察到鱼类的骨骼发育状况及骨骼特征。
           标本透明处理步骤如下 (参考白凤熙，2012；顾昌栋，1955；李婷和钱玉林，2017；吕建伟等，2001；薛大勇，2010；伍玉明，2010)：
   4.1

   标本固定
   选取完整的小型鱼类，如果是新鲜个体则需要清洗后绑在玻璃片上用70%酒精或10%福尔马林溶液固定一周左右，固定期间需更换1-2次固定液，直至标本硬化；固定好的标本放入清水中浸泡1-2 d。固定前、后在不损伤骨骼的前提下尽量去除鳞片、内脏和鱼体腔内腹膜等，如果标本个体小于5 cm，可不去除内脏。
   
   4.2

   软骨染色
   将标本置于30%冰醋酸 + 70%乙醇 + 阿利新蓝染色中。染色浸泡至软骨呈蓝色结束。把已染色的标本放入水中浸泡约1 d，中途勤更换水，直至标本内乙醇和冰醋酸彻底溶出。
   
   4.3

   预透明
   将标本放入1%-3%的氢氧化钾 (KOH) 溶液中进行腐蚀透明。氢氧化钾为强碱，具有很强腐蚀性，容易造成样本骨骼离散，因此浸制时间应根据样本大小自行增减，浸泡期间需注意观察标本的变化，待标本逐渐呈半透明状，隐约看到骨骼时，停止透明将其取出，用清水漂洗3-5次，一般需要2-3 d。如果透明效果不理想，可更换一次透明液或使用酶消化 (30%的饱和硼酸溶液 + 70%水 + 胰蛋白酶 (每100 ml加1-2 g)，水浴或烘箱36 °C下溶解) 的方法，达到满意效果为止。酶消化时温度控制是关键，最好控制在30 °C左右，接近透明时每隔0.5-1 h观察一次。
   
   4.4

   染色
   标本经过预透明处理后，用清水冲洗3-5次，然后使用染色液 (配制好的茜素红乙醇饱和溶液，加入9倍体积的1%氢氧化钾溶液) 对骨骼染色，着色时间根据鱼体大小决定，直至硬骨呈紫红色。软骨鱼染色忽略此步骤。
   
   4.5

   褪色和透明
   将染色的标本取出用清水冲洗3-5次，备用。将标本浸入氢氧化钾甘油溶液 (取5%的甘油加入1%氢氧化钾) 中漂白褪色，持续2-5 d，注意不宜过久，以免骨骼被漂白。
           漂白过的标本放入透明液 (水、1%氢氧化钾溶液和甘油配比为5:3:2 ) 中浸泡，浸泡至软组织透明，期间需更换溶液。这时骨骼组织已经基本清晰可见，软组织几乎无色，若效果不甚理想，可重复步骤4.3-4.5。
   
   4.6

   梯度透明
   硬骨透明：将经处理后的标本清洗后依次放入25%甘油→ 50%甘油→ 75%甘油→ 100%甘油，每个溶液梯度时隔 2-5 d，直至肌肉完全透明为止。
   软骨透明：将标本依次放入30%酒精→ 50%酒精→ 70%酒精→ 100%酒精中浸泡，每次间隔24 h，直至肌肉完全透明为止。
   
   4.7

   标本保存
   标本完全透明后浸泡于100%甘油长期保存；甘油在高温下会膨胀，常容易导致液体渗出，因此将标本放入保存容器后勿加满，应留下一些空隙。
   透明骨骼制作中硬、软骨染色液配方和脱色方法不止一种，熟悉基本操作后可选择适合的染色液、脱色剂进行制作。
   
   
   图21. 透明骨骼标本 A. 鲽形目鱼类骨骼染色；B. 海马外骨骼染色 (陈炜 摄)
   
   
   在鱼类学调查和研究中，从标本采集、固定、保存、测量和解剖到物种的鉴定，每一步均看似简单，但都要严格、规范地执行，确保标本的保藏价值和科学利用价值，并为进一步纵深研究做好准备和保障。
   

致谢

感谢中国科学院昆明动物研究所舒树森助理研究员、付贵权博士研究生，浙江省森林资料监测中心周佳俊，安徽大学孙佳琪，以及冯新明、王宽和陈炜先生等人在野外采集或标本照片提供上给与的帮助。感谢国家自然科学基金 (31872202)、中国科学院东南亚生物多样性研究中心资助 (Y4ZK111B01) 以及科技基础性工作专项"藏东南动物资源综合考察和重要类群资源评估" (2014FY210200)、"武陵山生物多样性综合考察"项目 (2014FY10100) 和中国科学院先导科技专项 (A) “物种多样性信息平台”子课题(XDA19050202) 执行过程中获得的宝贵资料。特别致谢中国科学院动物研究所伍玉明先生等人之前对标本采集规范化所做的研究和推进。

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