A Protocol for Field Collection and Specimen Preparation of Glires

研究背景

啮齿类动物是陆地生态系统中的重要组成，其连接着陆地生态系统中的初级生产者与次级消费者，具有进化历史漫长、种类繁多等特点。这一类群包括啮齿目和兔形目，其中啮齿目全世界目前已知32科，522属，2605种，为哺乳动物中物种最为丰富的目；兔形目全世界已知3科13属，108种 (Burgin et al., 2018)。啮齿类动物是研究现生哺乳动物多样性格局形成、野生动物对气候变化的响应与适应性进化等重要科学问题的理想材料 (Ge et al., 2021; Wen et al., 2021)。它们也是大量动物源病原微生物的重要野外宿主和传播媒介，是鼠疫、流行性出血热、莱姆病等法定报告传染病的重要媒介生物类群，因而是重要的检疫对象 (Yu et al., 2015; Guzzetta et al., 2017)。此外，部分栖息地泛化种类得益于人类发展和扩散历史，实现大范围的栖息地扩张，成为哺乳动物中最优势的入侵种类，如褐家鼠 (Rattus noevegicus)、黑家鼠 (R. rattus) 和小家鼠 (Mus musculus) 等，它们是有害生物防控的主要目标物种。另外，啮齿类动物繁殖快、种群数量大，啮齿类动物的采集对物种的生存不会造成较大影响，野外采集行政审批较为容易办理。疾控部门、农林鼠害防控单位、高校和相关科研单位对啮齿类动物开展系统的研究都需要大量的野外采样与调查，收集基础数据，进行标本和遗传资源的储备，以便后续研究工作的开展。
        本实验方案将按采集与标本制作过程中的时间先后顺序进行介绍，本着充分利用采集到的标本资源的原则，除了介绍啮齿动物自身遗传资源的收集和标本制作，还将简单介绍其体表寄生虫等实验材料的收集和保存。读者收集啮齿类动物样品和标本制作的过程中请务必戴好手套和口罩或面罩，做好安全防护工作。

材料与试剂

1. 安全防护：医用乳胶手套和防护面罩或口罩
2. 标本野外收集：一次性使用不同规格大小塑料密封袋
3. 信息记录：签字笔、记号笔、铅笔和采集信息记录本
4. 标本制作材料：防腐剂、脱脂棉花、竹签 (如烧烤签和牙签)、竹标签、针线包、废旧报纸等
   
5. 遗传组织样品取样与保存：冻存管、RNAholder、分析纯酒精、75%医用消毒酒精
6. 标本体表寄生虫处理：拟除虫菊酯类杀虫剂
7. 诱捕食物：花生米、肉片、豆腐干、苹果片、小鱼干等
   

仪器设备

1. 测量工具：直尺或者卷尺
2. 动物诱捕装置：鼠夹、鼠笼、谢尔曼鼠盒
3. 液氮罐
4. 小动物解剖工具套装 (包括眼科剪、眼科镊、骨剪、刀片、针线)
5. 电子称 (1 g-2000 g量程)
   

实验步骤

啮齿动物野外采集步骤分为：采集地点和季节确定、样线考察、装置安放、标本收集、标本预处理、标本称重和外形测量、遗传组织取样、皮张标本制作并上签和头骨标本制作与上签、标本保存共十个步骤 (表1)。对标本制作和取样的整体流程如图1所示。

表1. 本实验方案主要步骤和注意事项

一、调查地点和季节确定

根据研究任务选择考察地点。啮齿类动物迁移能力有限，不同物种偏好的植被环境存在较大差异。若需要完整地获得调查区域内的物种组成情况，设计考察样点和样线时要涵盖考察区域内不同的植被环境。
        比如：为了调查物种多样性海拔分布格局的季节性变化，针对每条样线上的海拔点分为早湿季 (4至6月) 和晚湿季 (7至9月)，按照海拔由低到高的顺序进行重复取样，两个季节中的取样方法和取样强度保持一致。为避免早湿季的物种调查对晚湿季的物种调查产生影响 (时间自相关)，同一海拔点在两个季节中样地所设置的位置水平距离大于200 m。

二、样线和样点选择

啮齿动物经常出没的地方会留下食物残渣、粪便等痕迹，仔细观察会发现它们经常爬行的路上出现的鼠道。根据我们的野外经验，靠近水源地和坡坎相接的地方啮齿类动物活动频繁。主要采用样线铗夜法、笼捕法对不同海拔样线上的啮齿类动物进行调查。以我们调查的卧龙国家级自然保护区为例：保护区海拔跨度为1150至6250 m，植被可分为：常绿阔叶林 (1600 m以下)、常绿落叶阔叶混交林 (1600-2000 m)、针阔混交林 (2000-2600 m)、寒温性针叶林 (2600-3600 m)、耐寒灌丛和高山草甸 (3600-4400 m)、高山流石滩稀疏植被带 (4400-5000 m)。我们对采样方法进行标准化设计，从而保证研究的一贯性和不同样线上结果的可对比性。在1200-6000 m间设置12个调查点，设置三条样带调查点间海拔间隔400 m，每个样点连续采样3个夜晚，每条样带150个鼠夹。样线通常选择地形平缓、植物种类多样，且人为干扰较小的地点。

三、捕鼠装置安放

啮齿目动物多数种类夜间较为活跃，需要在下午日落以前完成捕鼠装置安放；而兔形目鼠兔类群清晨和傍晚活动频繁，可以在白天安放捕捉装置。根据生境选择大小合适的鼠夹和鼠笼，布置样线。地表采集使用鼠夹按样线安置，每1 m一个鼠夹。通常鼠铗布设于每日下午16:00-18:30进行，以新鲜花生米和五香豆腐干为诱饵，次日清晨7:00-9:00收取标本。鼠笼定点设置，在有明显鼠洞和鼠道上有遮蔽的地方和洞口放置，需要做好醒目标记，以便鼠笼收回。如果遇上降雨天气，则尽量选择将鼠夹放置在能够避雨的地方，防止雨水将鼠夹诱捕设置破坏。
        鼠夹上放置花生米、小鱼片、豆腐干等作为诱饵。而鼠笼里面需要悬挂火腿肠、肉片、苹果片等作为诱饵。出于生物安全和对研究样本的考虑，尽量避免使用有毒的材料作为诱饵。由于地面置铗法和鼠笼不能够很好地适用于调查区域内的树栖类小型哺乳动物，通常还需要在倒树形成的空中廊道上设置鼠笼诱捕装置。此外，常规的鼠铗很难采集到鼢鼠、竹鼠等地下活动的啮齿动物，需要使用鼹鼠夹 (详见伍玉明，2010)。


图1. 标本处理与取样流程图

四、标本收集

在捕鼠装置安放隔夜以后，需要在清晨尽快收集捕捉到的标本，以免白天活动的动物对标本造成破坏，甚至是吃掉捕获的动物。比如，苍蝇发现鼠类尸体以后，会在上面产卵，将其作为繁育后代的理想场所；一些食肉动物发现动物尸体以后会啃食标本，将标本搬离原来的样线，造成鼠夹、鼠笼和标本的丢失。鼠夹采集到的标本通常都是死亡的个体，可用一次性塑封袋收纳。而鼠笼收集到的标本多数是活的个体，对于需要取RNA、体表微生物和活细胞等的研究是非常重要的材料来源，一般放在原有的笼中带回解剖点，待下一步处理。

五、标本预处理

在野外收集标本后，部分研究单位需要收集其体表的寄生虫，包括跳蚤、蜱螨等微小动物类群，这需要首先对标本进行灭虫处理，以免在取样和标本制作过程中动物体表的寄生虫转移到人体身上，造成病毒传播等事件发生。这需要在收纳标本的塑封袋中喷洒灭虫剂。通常选择拟除虫菊酯类灭虫剂。喷晒灭虫剂后，塑封袋密封放置二十分钟左右方可对标本进行后续处理。为了避免污染，塑料袋为一次性使用，不能重复使用。鼠笼采集的动物需要处死。比较安全的方法是将老鼠转移到厚塑料袋中 (> 20丝)，将其赶到袋子角落处，使用酒精闷死或者快速断颈处死。这个过程中需要佩戴较厚的防护手套，避免被动物咬伤。标本预处理后可进行其体表寄生物的收集，使用毛笔和小镊子将标本转移到提前灌注好寄生虫保存液的样品管中。

六、标本称重与外形测量

体重、头体长、尾长、耳长和后足长是啮齿类动物分类鉴定的重要形态学指标 (表2)。标本采集后需要即时收集这些信息，这些指标也是国家动物博物馆每号标本采集签上需要填写的信息 (图2)。不建议将标本冻存以后再测量，因为冻存的过程会导致标本变形。在称量前可以完成标本的解剖前拍照工作。在称量过程中，标本采集地、经纬度、海拔、生境、性别等信息也需要即时记录 (表3)。

表2. 啮齿类动物体重、外形测量信息记录


表3. 啮齿类动物标本野外采集信息记录简表



图2. 皮张标本纸标签正反面和头骨标本竹标签实例

七、皮张标本制作

标本制作与遗传组织样品取样同步进行，整体流程如图1所示。因为野外工作时间限制，通常需要选择皮张和头骨完好无损的标本进行制作。皮张标本制作可分为两种：纸板标本和脱脂棉填充标本。前者因为占用空间比较小，对于标本储藏空间较为有限的单位比较实用；而脱脂棉填充标本能够更好地保存标本的外形特征 (图3)。两种标本制作过程中有区别的地方如下表对比所示，其中开口位置、填充物质和缝合方法略有区别 (表4)。

表4. 两种常用皮张标本制作步骤对比


标本制作步骤参考伍玉明 (2010) 主编关于小型哺乳动物标本的标本制作过程，经过修改，详细步骤整理如下：

1. 小镊子夹住下腹部皮肤，轻轻上提，沿腹中线剪开至生殖器前端。若是制作纸板标本，则需要在生殖口前端垂直于腹中线剪开。
2. 沿开口剥离皮张，注意不能将腹腔剪破，造成腹腔内液体和食物残渣流出，污染皮张标本。
3. 剪至生殖口处时，若是雄性个体可以根据研究需要确定是否保留阴茎骨标本。
   
4. 分离皮张至后足，在膝关节下方将胫骨剪断，并从腿骨上分离肌肉样，作为遗传组织样品保存。如果需要保留躯干骨，则需要将皮肤分离到踝关节处。
5. 剪开尿道处皮张与腹部的连接，将皮张分离到尾根部，左手捏住根部，右手用镊子将尾骨和尾部皮张抽离。
6. 尾部抽离成功后，继续分离皮张至前腿。同样在膝关节下方将前腿剪断。
7. 分离皮张至耳基部，用解剖刀片将耳基部割开。
8. 继续往前剥离至眼部，轻轻剥离眼部皮张，注意不能将眼部皮张剪得开口过大。
9. 继续分离皮张至嘴唇，轻轻割开，最后剪断鼻软骨，将皮张与身体分离。
10. 剥离下来的躯干部分根据研究需要决定是否保留，但头骨是标本鉴定的重要结构，所有个体均需要保留。野外环境无法即时制作头骨标本，可以用75%酒精保存。每个头骨标本需要挂上铅笔标记采集号的竹标签 (图1)，以便与采集记录对应。
11. 皮张分离以后，将其摊平，清除内表面残留肌肉和腺体。涂抹防腐剂，在腿部和头部适当多涂抹一些防腐剂。
12. 在前肢和后肢部位残留腿骨上缠绕脱脂棉花，尽量恢复皮张剥离前腿部的形状。
13. 大镊子从剥离皮张的中间穿过，夹住鼻吻部，将皮张标本正表面翻出。
14. 根据标本大小，制作三角形的棉花填充物。如果标本个体比较大，需要在棉花中间加入与体长大小近等的竹签，起到支撑作用。
15. 镊子夹住制作好的棉花填充物前段，轻轻塞入皮张标本。棉花若有多余，可从后部扯掉，要是不足，需要在两侧添加，使标本饱满。
16. 准备长短合适的牙签，适当缠绕棉花，插入前足，起到支撑和固定作用。
17. 准备长短、粗细合适的竹签，插入尾部，直至尾尖，腹端适当留下部分，并用棉花铺垫。
18. 缝合腹部和吻部开口。
19. 固定采集信息签在后足踝关节上部。
20. 适当整理标本，前足前伸，后足后伸，脚掌向下，并用大头针将标本固定在纸板上。
21. 长途运输过程中为了防止标本被压坏或者是挤压变形。可以使用报纸轻轻将标本裹在中间。标本之间使用棉花相隔。标本运回实验室以后放置干燥处晾干。
22. 标本经过灭虫和杀菌处理，和头骨标本一起转移至正规标本馆保存。
    
    
    图3. 棉花填充标本与纸板标本的对比 A1-A2. 大娄山猪尾鼠 (Typhlomys daloushanensis)；B1-B2. 中华姬鼠 (Apodemus draco)
    
    

八、遗传组织取样

根据研究需要，在收集时已经死亡的个体需要取肌肉、肝脏等组织作为DNA保存的样品。而对于收集时活着的个体 (笼捕)，需要取脑、心、肝、脾、肺、肾、睾丸、卵巢等不同的组织，以保存RNA和细胞组织样品。取样过程中，最重要的注意事项就是防止样品污染。因此，取不同的组织或者不同个体的样品前需要对解剖工具进行仔细清洗，减少污染发生。不同遗传组织样品保存液体要求各不相同。常规DNA样品保存一般使用95%高浓度乙醇，而RAN组织保存有RNA later，RNA holder等试剂。单细胞测序常用美天旎组织保存液 (catalog number: 130-100-008)。在野外条件，使用RNA保存液保存样品需尽量在低温条件下，比如使用小型车载冰箱，或者使用冰袋。取样时需要将组织剪成小块，取样后将样品常温静置2-4 h，以便保存液充分浸透组织。保存液与组织的体积比为5:1。

九、头骨标本制作

头骨标本是哺乳动物分类鉴定、功能形态学研究等的重要材料 (图4)。头骨标本制作最常用的方法是虫咬法。具体步骤如下：

1. 标本保存于75%酒精带回实验室。制作前需要脱酒精处理，一般使用清水浸泡24 h以上，期间更换清水3-4次，酒精浓度已经降到较低水平。
2. 脱去酒精后，倒掉冷水，并使用90 °C以上的热水浸泡头骨20 min，期间更换热水2-3次。或者使用沸水煮头骨5-10 min，使肌肉和头骨蛋白组织变性但骨骼间连接不被破坏。
3. 倒掉沸水，将头骨标本放入瓷盘中，置于通风处晾干。
4. 将晾干的头骨分别放入塑料小格盘中，每个格子放置1号标本。
5. 将黄粉虫放入小格盘，确保每号标本都有黄粉虫啃食，而标本竹签标记不会混淆。
6. 适时检查标本被啃食的情况。如果肌肉和骨髓已经被取食掉了，需要使用牙刷轻轻刷洗标本，并用小竹签或者镊子检查颅腔中脑组织是否已经清理干净，并用清水轻轻冲洗。
7. 头骨标本肌肉和其它组织清理干净以后，放置晾干。装入小塑封袋，写好标签，并置入标本盒，经消杀处理，入库保存。
   
   
   图4. 制作完成头骨标本实例，大足鼠 (Rattus nitidus)
   
   

十、标本保存

皮张和头骨标本是啮齿类动物研究的重要材料，很多标本需要保存几十年甚至几百年，因此需要有正规的标本收藏柜收纳保存。保存过程中，需要预防小蠹虫等对标本的损坏，每年安排消杀工作，确保标本的安全。

致谢

研究团队受到第二次青藏高原科学考察相关专题和国家自然科学基金的资助 (No. 2019QZKK0402, 2019QZKK0501, 31872958)；Bio-protocol编辑团队和匿名审稿人为此文提供宝贵修改建议；特此致谢。

参考文献

1. 伍玉明. (2009). 生物标本的采集、制作、保存与管理. 科学出版社. 北京. ISBN：9787030270382.
2. Burgin, C. J., Colella, J. P., Kahn, P. L. and Upham, N. S. (2018). How many species of mammals are there? J Mammal 99: 1-14.
3. Ge, D., Feijó, A., Wen, Z., Abramov, A. V., Lu, L., Cheng, J., Pan, S., Ye, S., Xia, L., Jiang, X., Vogler, A. P. and Yang, Q. (2021). Demographic history and genomic response to environmental changes in a rapid radiation of wild rats. Mol Biol Evol 38(5): 1905-1923.
4. Guzzetta, G., Tagliapietra, V., Perkins, S. E., Hauffe, H. C., Poletti, P., Merler, S. and Rizzoli, A. (2017). Population dynamics of wild rodents induce stochastic fadeouts of a zoonotic pathogen. J Anim Ecol 86: 451-459.
5. Wen, Z., Ge, D., Feijó, A., Du, Y., Cheng, J., Sun, J., Wang, Y., Xia, L. and Yang, Q. (2021). Varying support for abundance-centre and congeneric-competition hypotheses along elevational transects of mammals. J Biogeogr 48: 616-627.
6. Yu, P. B., Tian, H. Y., Ma, C. F., Ma, C. A., Wei, J., Lu, X. L., Wang, Z., Zhou, S., Li, S., Dong, J. H., Xu, J. R., Xu, B. and Wang, J. J. (2015). Hantavirus infection in rodents and haemorrhagic fever with renal syndrome in Shaanxi province, China, 1984-2012. Epidemiol Infect 143: 405-411.