Field Collection and Specimen Preparation of Polychaete Annelids

研究背景

多毛纲是环节动物门中最大的纲，主要栖息于海洋环境，是潮间带及潮下带最常见的大型底栖动物类群之一。我国海域辽阔，海岸线长，生境类型复杂多样，多毛类动物多样性非常高。在各项海洋底栖生物资源调查过程中发现，多毛类动物样品数量很多，但多数虫体并不完整，而样品的完整性直接影响物种鉴定工作，进而阻碍多毛纲动物分类学及生态学研究的发展。针对这一情况，本文对多毛纲动物的现场调查取样、标本分拣、样品的处理与保存等工作进行详细介绍，使初学者能快速掌握多毛纲动物的野外采集方法和样品处理方法。

材料与试剂

1. 离心管、塑料样品瓶、标本瓶 (玻璃)
2. 野外采集情况记录本、采集标签、记号笔、铅笔等记录工具
3. 无水硫酸镁
4. 凡士林软膏
5. 薄荷脑
6. 70%和75%的乙醇溶液
7. 5%和7%的福尔马林溶液
8. 1 g/L虎红酒精溶液 (使用95%或无水乙醇配制)
   

仪器设备

1. 铁锨、铁铲、金属锤及铁凿等
2. 捞网 (孔径1 mm)
3. 大、中、小不同型号的钝头镊子、尖头镊子、解剖剪等
4. 手套、雨具 (雨衣、雨鞋等)
5. 培养皿、白色搪瓷盘
6. 塑料桶或整理箱
   
7. 分样筛 (筛网孔目1 mm)
8. 科考船或渔船 (须配有绞车、吊杆)
9. 采泥器 (抓斗式采泥器和箱式采泥器等，参考国家标准GB 12763.6—2007)
10. 阿氏网 (网口宽度1.5-2.0 m，长0.5 m)
11. 涡旋分选器 (1套)
12. 套筛 (筛网孔目上层1 mm，下层0.5 mm)
13. 定量框 (25 cm × 25 cm × 30 cm)
14. 面罩、呼吸管、潜水服、气瓶等潜水装备
15. 手持式GPS
16. 体视显微镜
17. 照相机
    

实验方法

一、多毛类样品的野外采集

采集过程中，要注意保护环境，尽量减少或避免对当地生境的干预或破坏。因此，每个物种的采集数量要适量，不可贪多。对于不同地点、不同站位、不同采集日期的样品要分开存放，并做好采集记录，写明船名、采集地经纬度、采样时间、采集时海况情况、采集方式、采集人以及所获样品的数量和种类等信息，及时投放采集标签 (写 明采集地点、时间、采集人、经纬度及生境信息等) 和鉴定标签 (种名、鉴定人及鉴定 日期等)。对于细小易断或已经断裂的虫体于离心管内单独保存，便于后期处理样品和进一步研究工作。另外，采集时应对采集区域及所采集样品拍摄原位采集照片，便于后期样品的处理和鉴定工作。

1. 潮间带采样
   1.1

   岩石海岸采集

   1)

   选择取样时间。查看取样地点潮汐表，待潮水退潮时，开始采集工作。

   2)

   选择取样地点。岩石海滩常栖息有较大型的多毛类样品，但并非所有的岩石海滩都可以采到大量多毛类动物。通常情况下，在坡度不大、乱石块较多且有藻类生长的岩石海岸更容易采集到多毛类样品，而陡峭的岩石海岸，由于常年经受海水的直接冲刷，多毛类数目和种类都比较少，较难采集到 (李新正等，2010)。

   3)

   使用钝头镊子、铲子等工具翻取石块下方的碎石或泥沙，发现多毛类动物后，快速翻开石块使虫体全部暴露后使用镊子夹取。

   4)

   岩礁环境中的牡蛎丛中常可发现自由生活的沙蚕，可使用镊子小心夹取。除去自由生活的多毛类动物，还应留心观察岩石或贝壳上附着的管栖多毛类，比如龙介虫的栖管为石灰质，附着于岩石或贝壳上，直径大约2-3 mm。对于这类管栖多毛类动物，采集时可使用铁凿将栖管及虫体凿下，当虫体一半缩入栖管内部时，直接夹取会使虫体断裂，可使用镊子轻轻刺激洞穴口处的虫体部分，虫体受到刺激会收缩，可自动滑出洞穴，获得完整虫体。

   5)

   将所获多毛类样品及其栖管放入盛有海水的样品瓶中暂养。

   6)

   填写采集记录和采集标签，及时将采集标签投入样品瓶内，带回实验室做进一步处理。
   1.2

   沙滩、泥沙滩以及泥滩采集

   1)

   查看取样地点潮汐表，待退潮时开始进行采集。

   2)

   潮水退去后，观察滩面上是否有多毛类栖管或洞穴，栖管通常高于滩面1-2 cm左右。
   
   
   图1. 退潮后沙滩上的栖管
   
   

   3)

   找到栖管或者洞穴后，使用铁锨、铲子等工具挖开栖管或洞穴周围的泥沙，即可获得穴居或管栖的多毛类，有时会采集到空管，用手轻捏栖管中部，即可探知栖管内有无虫体。将所获多毛类样品及其栖管放入盛有海水的样品瓶中暂养。不同的动物其洞穴或栖管的形态和质地有所不同，采样方法也略有差异，如：
   a.  巴西沙蠋 (沙蠋科)：沙蠋个体较大，栖息于"U"形洞穴中，一端 (头端) 下陷为漏斗状，另一端 (尾端) 在沙滩表面具有一堆圆形泥条状排泄物 。使用铁锨铲去泥条状排泄物后可以见到约1 cm粗细的洞口，用铲子沿洞口方向一薄片、一薄片地快速铲去泥沙，露出鲜红色的虫体后开始沿穴孔方向迅速深挖，可以采到完整的标本 (武兆发和和振武，1954)。
   b.  巢沙蚕属 (欧努菲虫科)：巢沙蚕属动物的栖管伸出沙面的部分常附着有海草、碎贝壳或砾石等较大的颗粒，根据这个特点可以较容易地找到该属动物穴居的管口，然后使用铁铲深挖就可得到长约12-15 cm的管子。
   c.  磷虫科：日本中磷虫是细沙质底质生境中的常见物种，具有"J"形栖管，大潮期间在退潮后的沙滩上常见其栖管一端露出沙面，使用铁锨在栖管周围深挖40 cm左右的坑，不要铲断栖管，最后连同泥沙一同掘出。
   

   4)

   选择取样位置，使用铁锨深挖约30 cm深的泥沙，观察并使用镊子挑拣出肉眼可见的多毛类。

   5)

   将沉积物铲入分样筛，直接在海水中淘洗，筛除掉细小的泥沙。

   6)

   使用镊子挑选截留在网筛内的多毛类动物，并置于盛有海水的样品瓶中暂养；若未能及时挑拣出全部多毛类动物，可将沉积物残渣另行装瓶，带回实验室放入白瓷盘中继续挑拣。

   7)

   填写采集记录和采集标签，及时将采集标签投入样品瓶内，带回实验室做进一步处理。
2. 潮下带采样
   潮下带常年覆盖海水，因此采集过程需要借助科考船和专门的采样工具进行，如：采泥器、阿氏底栖拖网及专业的潜水装备等。
   2.1

   采泥器采样
   采泥器是潮下带定量采集多毛类动物的工具，使用采泥器可以采集到大量多毛类动物。常用的采泥器有：抓斗式采泥器和箱式采泥器。不同类型或品牌的采泥器操作方法略有差异，具体使用方法可参照使用说明书，另外，采泥器需要借助绞车投放和提升，因此，科考船应配备有绞车和吊杆，并由专人操作。采泥器采集沉积物样品中获取多毛类动物的方法如下：

   1)

   科考船航行至指定地点后停船，开始准备作业。

   2)

   使用采泥器采集底泥，排除采集器中的上覆水后将底泥倒于铁盘中。

   3)

   样品初选：首先观察所获泥样，并挑拣泥样表面的多毛类。对于管栖多毛类，应首先徒手将栖管分离出来，悬垂栖管使虫体自由滑出，或是用剪刀剪开栖管，取出虫体，连同栖管一同保存。

   4)

   泥样淘洗：打开涡旋分选器的开关和进水阀门，出水口处放置套筛，使用铁锨将采到的沉积物样品铲入涡旋分选器，利用水流搅动样品，为避免进入筛网的沉积物堵塞套筛，可通过调节进水阀门控制水量，也可另接水管及时冲刷淘洗套筛，待出水口流出的水流颜色不再浑浊时即可认为已经淘洗干净。
   
   
   图2. 涡旋分选装置和套筛
   
   

   5)

   样品分拣与预处理：使用镊子挑选截留在套筛内的多毛类动物样品并置于盛有海水的样品瓶中暂养。

   6)

   将沉积物残渣另行装瓶，带回实验室继续挑拣较小的多毛类动物。

   7)

   如果样品需要长时间放置后才处理，须加入70%的无水乙醇暂时保存。

   8)

   填写采样记录表及采集标签，并在每个样品瓶或样品袋内及时投放采集标签。

   9)

   将所获样品及沉积物样品带回实验室做进一步处理，若不能及时分离和处理，应更换一次固定液。
   2.2

   阿氏拖网
   阿氏拖网不是采集多毛类动物的主要工具，但在作业过程中经常收集到大个体多毛类动物，这类样品也应注意收集。常用阿氏网的网口为1.5 m × 0.5 m，网口处网目为2 cm，网目大小从网口到囊网依次递减，囊网处为0.7 cm。通常拖网所获鱼类、虾蟹等甲壳类动物较多，多毛类动物相对较少，只能采到个体较大、且自由生活的多毛类动物，如鳞沙蚕、刺管萨欧虫等。

   1)

   科考船航行至指定地点，停船，开始准备作业。

   2)

   开动绞车将网具吊于船舷外，慢速放出绞车绳索，使放出绳索长度为水深的3倍，使用GPS进行定位，并记录此时的时间和经纬度信息。

   3)

   保持2-3节 (约4-6 km/h) 低速航行约15 min。

   4)

   开动绞车起网，使用GPS进行定位，记录此时的时间和经纬度信息，将网拉回至甲板。

   5)

   解开网袋，将渔获物倒入搪瓷盘，网内若有泥沙，则移入套筛内冲洗。

   6)

   挑拣套筛内及挂在网目上的多毛类样品，连同栖管一并装入盛有海水的样品瓶内。

   7)

   填写采样记录表及采集标签，并在每个样品瓶或样品袋内及时投放采集标签。

   8)

   带回实验室做进一步处理。
   2.3

   潜水采集
   矶沙蚕科、仙虫科等科的部分物种常生活于珊瑚礁生境。珊瑚礁通常水浅且高低不平，拖网或采集器采集会破坏珊瑚礁环境。珊瑚礁区域适宜潜水采集，潜水采集需至少2名有潜水证潜水员参与。

   1)

   潜水员手持捞网采集附着于珊瑚礁表面的多毛类样品。

   2)

   珊瑚礁有大量孔洞，内栖息有大量多毛类，遇到潜水者，动物会藏匿于空洞内部，采集较为困难，因此，在不破坏珊瑚礁生态的前提下，可以选择1-2块已经死亡的、孔洞较多的珊瑚礁礁石，带回岸边。

   3)

   使用锤子等工具，轻击礁石，使孔洞内的多毛类虫体震落，逐一挑拣虫体。

   4)

   使用锤子、凿子等工具，将礁石敲碎，逐一挑拣礁石内多毛类动物。敲击和挑选过程中，当虫体一半位于洞穴内部时，可使用镊子轻轻刺激洞穴口处的虫体部分，或者轻轻敲击该动物穴居部位的礁石，使得自动滑出洞穴。

   5)

   将所获多毛类样品置于盛有海水的样品瓶内暂养。

   6)

   填写采样记录表及采集标签，并在每个样品瓶或样品袋内及时投放采集标签。

   7)

   带回实验室做进一步处理。

二、多毛类样品的室内处理与保存

1. 沉积物样品的处理
   1)

   使用滴管吸取适量虎红酒精溶液加入装有沉积物的样品瓶中，摇晃均匀，静置染色6-24 h；若沉积物样品数目不多或处理样品时间足够充裕，可跳过染色步骤，直接进行第2步冲洗操作后在显微镜下挑选多毛类样品。
   2)

   将染色后的沉积物样品倒入孔径为0.5 mm的网筛内，使用自来水冲洗掉泥沙和多余染料。
   3)

   将冲洗干净的沉积物样品倒入白色搪瓷盘或培养皿内，在体视显微镜下挑选多毛类样品。
2. 多毛类样品的室内处理
   2.1

   预处理

   1)

   将野外采集的多毛类动物置于装有新鲜海水的搪瓷盘中培养，使用镊子和毛刷等工具清理掉表面附着的泥沙、分泌的黏液等，并尽量减少刺激或损失。

   2)

   对于带有栖管的样品，使用解剖刀或剪刀剪开栖管，清理好表面的泥沙，并与对应的虫体放置在同一标本瓶内保存。

   3)

   对于一些重要的有生态意义或其他研究价值的物种，拍摄清晰的整体照片，防止长期保存后体色或特异性的斑点褪色，便于后期研究与对比。
   2.2

   麻醉和固定
   多毛类动物虫体柔软易断，具有较强的收缩能力，受到刺激会发生蜷缩，因此，在保存之前对其进行麻醉处理，可使虫体保持自然舒展状态，便于后期的观察和鉴定。常用的麻醉剂有硫酸镁、薄荷脑和70%乙醇等。

   1)

   将清洗干净的虫体置于盛有新鲜海水的搪瓷盘中，使虫体完全伸展。

   2)

   缓慢加入70%的乙醇溶液 (或硫酸镁粉末，或薄荷脑，或淡水，也可混合使用)，一次用量不宜过多，用镊子碰触虫体不再收缩即可认为麻醉完成。

   3)

   对于吻沙蚕、齿吻沙蚕科的样品，在麻醉后，使用镊子轻轻挤压虫体头部使吻伸出以暴露重要鉴定性状。

   4)

   将麻醉后呈舒展状态的样品移入装有7%福尔马林溶液 (或70%乙醇) 的培养皿内，固定样品的形态。
   2.3

   保存

   1)

   形态固定好后，将样品转移至盛有75%乙醇 (或5%的福尔马林) 的广口瓶瓶内保存。

   2)

   将剥离的栖管、采集标签和鉴定标签一起投入广口瓶中。

   3)

   对于酒精浸制标本，使用毛刷在瓶口处均匀涂抹一层凡士林软膏，以防酒精挥发，标本腐烂。

   4)

   放置在干燥通风的环境下，定期检查保存情况，及时添加保存液。

致谢

感谢国家自然科学基金青年项目 (32000349)、江苏省盐土生物资源研究重点实验室开放课题 (JKLBS2019004) 及江苏省产学研合作项目 (BY2020638) 对本工作的支持。

参考文献

1. GB 12763.6—2007. 海洋调查规范, 第6部分: 海洋生物调查.
2. 李新正，刘录三，李宝泉. (2010). 中国海洋大型底栖生物-研究与实践. 海洋出版社. 北京. ISBN: 9787502778439.
3. 武兆发，和振武. (1954). 海产无脊椎动物的采集方法和处理方法. 生物学通报 07: 46-49.