Main Collecting and Describing Methods of Mayfly Specimens

研究背景

蜉蝣起源古老，特征原始，是研究有翅昆虫起源与演化的重要对象。同时，其分布广泛、个体较大，对生态因子的变化反应敏感，也是重要的水质指示生物。然而，其成虫不食，器官退化、肌肉羸弱；稚虫生活于水中，壁薄体弱，形态与成虫也相差很大。故采集蜉蝣标本不仅要方法多样，还要尽可能积累和对应不同生活史阶段的材料，更要对标本进行妥善地保存与运输。本文详细介绍了蜉蝣标本的采集、对应、保存与研究方法，对水生生物多样性、水质监测以及昆虫起源与演化领域的专业人士有一定的启发作用，也可为昆虫爱好者借鉴参考。

材料与试剂

1. 乙醇
2. 二甲苯
3. 加拿大树胶
4. 水
5. 卡诺溶液（Carnoy fluid，由冰醋酸10%、95%乙醇60%、氯仿30%配制而成）
6. 卡尔溶液（Kahle’s fluid，由甲醛11%、95%乙醇28%、冰醋酸2%、水59%配制而成）
   

仪器设备

1. 广口玻璃瓶
2. 各种网（水网、扫网、气网、D型手网、手网、拖网）
3. 防水服和雨衣、雨鞋等
4. 采泥器
5. 镊子
6. 标本瓶或类似容器（各种规格）
7. 标签纸
8. 铁耙
9. 铁锹
10. 放大镜
11. 马氏网
12. 白布
13. 诱虫灯
14. 筛子
15. 白瓷盘
16. 剪刀
17. 培养皿
18. 水簇箱
19. 高压汞灯（160-250 W）
20. 黑光灯或诱虫灯
21. 照相机
22. 显微镜
23. 解剖镜
24. 微距镜头
    

标本采集方法

一、采集稚虫

1. 溪流生境
   在水深小于0.5 m且水流速度适中的溪流中采集蜉蝣稚虫主要靠网捕 (周长发等，2010和2015)。常用且便于携带的网为手网 (hand screen)。这种网用尼龙网布做成 (网眼小于1.0 mm²为佳)，两边用短棍支撑，携带时可只带纱网，在采集地穿上两根细竹竿或树枝即可。采集时两人合作或单人操作 (图1D-E，图3A)。两人操作时，需要穿上防水衣裤，一人在网前用脚或手搅动水下的底质，将石块等掀起让水冲洗。生活于底质中的水生昆虫就会被水流冲起并会随水流动。另一人在下游1.0-2.0 m处撑住手网，稍向后倾斜，等流经网中的水再次变清后，小心捞起手网，将网上的水生昆虫同底质一起倒入白盘中进行挑选。挑选出的蜉蝣稚虫可直接放于95%或更高浓度的乙醇中。单人操作时可背对来水方向，双手扶网，用脚在网前踢起水底底质。当然也可用改进型的固定式采集网：这种网一般用较沉重的金属构架和网布组成，可单人操作 (图1A)，但需要较大的运输工具，对于有自备车的采集人员较适用。
   
   
   图1. 采集蜉蝣稚虫常用工具和方法示意
   
         在水较深或水流较慢的溪流中或池塘湖泊的边缘处，可使用长柄的D型手网采集 (图1B)。捞取时采集者身穿防水服，手握网柄，在尽可能多样的小生境中进行捕捞后，再将获取物倒入白盘中挑选所需标本。
         对于很浅且窄的溪流或小沟，水流的流速较慢，上述方法效果很差，也不太好操作。这时需要用一种较小的圆网或三角网 (与D形网类似，但柄较短)：用手将较大的石块拿起后在网中洗刷，并用手将较小的石块等底质拔或耙到网中后，再倒入白盘中挑选。
         如果上述方法采集到的底质较多或倒入白盘后水变得太混浊，最好在倒入前先在干净水中对网内物进行清洗或筛洗后再倒入盘中挑选。
2. 湖泊或大河生境
   在湖泊或大江大河的近岸处采集时，可参照使用D型网的方法。
         在人不能涉及、水较深的湖中央或河中间进行采集时，最好使用采泥器 (图1C) 或拖网 (图1A)。采泥器用来采集泥中的蜉蝣，而拖网主要采集水体中的蜉蝣。
3. 人工基质
   如果计划在某地进行较长期彻底的采集或定期采集 (周长发等，2015)，可使用人工基质。简易的人工基质可用较结实牢固的塑料箱来制作：在塑料箱体上扎数量足够多的细小孔洞后，装上一些石块、树叶等基质，沉入水中 (主要是溪流水体中或江河中)，放置足够长的时间后再取出 (如一个月或一个季节)，挑选出其中的蜉蝣稚虫。塑料箱也可由塑料筐或木条筐内铺上具有很小网眼的金属质或尼龙质纱网来代替。
4. 多样生境中采集
   就一般性、人可以涉入的溪流而言，其小生境是多样的。故在某地进行采集时，特别要注意到多样的生境中进行采集，如水边、水中、水草中、石块下、泥沙中、淤泥中、枯枝落叶下、深水区、浅水区、流水区、静水区等。也要尽量使用多样的工具和方法进行采集 (周长发等，2010和2015)。
   
   
   图2. 采集蜉蝣成虫采用方法和工具示意 A: 网扫；B：便携式诱虫灯灯诱；C：接电式强光灯诱取
   
   

二、采集亚成虫和成虫

1. 灯诱
   采集成虫期的蜉蝣主要依靠灯诱 (周长发等，2010和2015)，一般以高压汞灯 (160-250 W) 为佳，但由于要用交流电源，使用场所受到一定限制 (图2C)。使用黑光灯或专门的诱虫灯在水边进行灯诱，效果很好，且使用直流电池，场所不受限制且小巧、轻便、耐用，可用于环境相对较好和较偏远的地方 (图2B，图3B)。灯诱蜉蝣要注意以下两点：一是要尽可能靠近水边，一般最好不要离水边10 m以上。另一个是时间：蜉蝣羽化的时间大多集中在天黑前的一个小时左右和黎明天亮前。当然整晚灯诱效果最好，但不易办到。因此，早晚各诱一次是必要的。
         灯诱的具体方法：将灯放在水边至少半米高或直接放在采集盘上。采集盘可用一般实验室所用的白瓷盘或塑料盘。盘内放入一定量的乙醇或洗衣粉液即可 (图2B，图3B)。这种方法诱集的蜉蝣种类较多，但事后挑选标本花费时间较长。另可将灯挂于白布前，用镊子蘸乙醇粘住蜉蝣竖立在背上的翅，直接放入80%-90%乙醇中 (图2C)。这种方法的优点是采集当时即可直接保存，但因受其它飞虫的干扰，往往多样性较低，特别是一些小型种类很难采得。
   灯的架设也很讲究。晴天时最好选择水边较高的大石块上进行灯诱，也可人为地架高诱虫灯。如果天气不好，最好在水边可避雨的高处 (如建筑的阳台、房顶、水边棚屋内) 灯诱。这样做的目的是让灯光照射到尽可能大的范围和空间。
2. 网扫
   也可在白天用专门的扫网来采集蜉蝣成虫和亚成虫 (图2A)。这种网一般由较坚固的柄和坚韧的网布制成。采集时双手握紧网柄用力在灌木或草丛上来回扫动，并不时地用镊子将扫到的蜉蝣放到装有乙醇的瓶中。也可在树叶下、草丛中、桥下等隐蔽处仔细寻找，有时也可发现数量可观的蜉蝣。
   
   
   图3. 采集蜉蝣实际方法示意 A: 单人用手网采集蜉蝣稚虫；B：便携式诱虫灯灯诱蜉蝣成虫
   
   
3. 人工网罩
   在条件较好处 (如水体宽窄适中、无人干扰、附近有供人长期居住的设施等)，可使用人工网罩采集成虫期蜉蝣。这种方法类似于建塑料大棚：在一段溪流或一部分水体的上方搭建木质或竹质框架 (其高度至少可容采集者出入)，再用网或纱或布等将其封闭 (最好用遮光能力不强的类似于蚊帐的尼龙网或白纱网，尽量模拟自然条件以利于蜉蝣羽化)，定期到网内收集羽化出来的蜉蝣即可 (周长发等，2015)。
4. 室内饲养
   为更多地采集，也为更好地将每种蜉蝣的成虫期和稚虫进行对应，采集时可将部分老熟稚虫带回室内进行饲养，运气好时一两天内就可养出。饲养时可将蜉蝣稚虫连同其生活水体中的水、碎石、底质和枯叶等底质一并放出桶内或盆内带回室内饲养 (图4A)，让一部分的底质突出水面以外，并用衣服或纱布等盖住饲养设备，一则挡光，二则防止羽化出的成虫逃脱。条件允许时在饲养过程中可间断性地或不间断地用充氧泵给水中充气，以补充氧气。收集饲养出的亚成虫、成虫，连同稚虫蜕下的皮，一起放入乙醇中保存。这样可以准确配对。有条件时可购置专门的可自动净水和充氧的水簇箱进行饲养。
5. 野外饲养
   蜉蝣稚虫对水质的要求较高，室内饲养时的成功率一般很低。因而条件允许时可在野外进行饲养 (Edmunds et al., 1976; 周长发等，2015)。
         野外饲养主要有两种方法：一是在采集地合适处人工开挖出或区隔出一个相对封闭的区域 (如溪流的浅滩、池塘的浅岸处)，使其内部的水与采集地的水通过地下或很小的缝隙相通的以保证水质和其理化性质。将采集到的老熟蜉蝣稚虫放入人工水体中，并将人工水体用网、布或帐等罩住，它们要足够大，以方便采集人员出入。羽化出来的蜉蝣就会全部停留在网罩内，采集者可入内收集蜉蝣。二是用多个较小的人工饲养桶进行饲养。这种饲养桶可用塑料桶制作 (图4A)：将桶 (一般儿童挖沙子用的小桶那般大或更大的桶) 的下半部四壁和底上扎出许多细小的孔洞，桶口用布或网或纱封住。将采集到的老熟蜉蝣稚虫放入桶中后，再将它们一同放入浅水处 (使桶的下半部分有部分没入水中) 即可；或将它们漂浮在水面上 (桶外安置上泡沫塑料或木框等)，并用框或绳索等将它们固定在某地而不能随水流走就行。可定期收集羽化出来的蜉蝣 (Edmunds et al., 1976; 周长发等，2015)。
         采集到的亚成虫可放入网中或纱帐中 (网中最好能放上一桶或一盆水)，待其羽化为成虫后再收集保存。也可用上述野外饲养的设备或设施来获得成虫，其效果更佳。
   
   

三、挑选标本
采集稚虫时将已倒入白盘中的蜉蝣从底质中挑选出来需要极大的耐心和经验。具体方法如下：向白盘中注入少许水，让其淹没盘内容积的1/4到 1/3为佳；让底质和水充分混和后，将白盘放在采集者的大腿上，并不时调换一侧白盘的高度，以使水只停留在白盘的一侧；这时将底质向有水处一点点地转移，隐藏在底质的蜉蝣稚虫就会运动 (如爬行和游泳等)，相对比较容易发现和采集。等底质全部转移完毕后，再放低另一侧白盘，并再一次地转移底质并挑选标本。如此重复至少5次以上，以确保盘中的蜉蝣尤其是个体十分微小的种类都能全部获得。
       对于有经验的采集者而言，每种蜉蝣的每个虫态能采集到二三十头标本就可以了，太少可能会因运输过程的损耗等而使完整的标本太少，太多则增加工作量。当然，没有把握时可在某地采集的前一两天收集得到的全部蜉蝣标本，再往后就可有意识地增加那些数量较少种类标本。


图4. 蜉蝣饲养及保存方法和工具示意 A: 简宜的饲养桶 (可直接放入溪流边浅水中)；B：小瓶外套大瓶方法 (两种瓶内都装满保存液)

标本保存方法

野外采集时，可将采集到的蜉蝣成虫和亚成虫标本直接放入80%-95%乙醇中。保存的容器最好是带塞的塑料瓶或玻璃瓶。待瓶中的蜉蝣足够多时 (一般以达到容器的2/3处为佳)，将乙醇加满，使瓶中不留空气。返回室内后，将采集到的标本初步按不同种类分开，长期保存于严密的玻璃小瓶中。
       最常用的保存蜉蝣稚虫的方法是直接放于95%或更高浓度的乙醇中。因为稚虫本身带有水，所以要用浓度高的乙醇。更好的方法是将标本直接放于温和的卡诺溶液中 (Carnoy fluid，由冰醋酸10%、95%乙醇60%、氯仿30%配制而成) 24 h后取出，再放入80%乙醇中保存。如果条件不允许，较长时间放于卡诺溶液中也不会对标本产生损害。另一种可代替卡诺溶液的是卡尔溶液 (Kahle’s fluid，由甲醛11%、95%乙醇28%、冰醋酸2%、水59%配制而成)。这种方法在野外考察中非常有利，因为59%的水不用携带。将标本放于卡尔溶液一周左右后取出再放入80%乙醇中。用这两种溶液保存的稚虫，可保持色泽且坚韧，足、触角和鳃等都不易脱落，还可供内部解剖研究所用 (Edmunds et al., 1976; 周长发等，2015)。
       因为蜉蝣稚虫、成虫都很脆弱，标本的碰撞可能会导致足、鳃、触角或尾丝的缺失。在路途中，标本瓶需装满保存液，不要留有一点气泡。可将标本放于小瓶子里，再将其放入稍高于小瓶子的广口玻璃瓶或塑料瓶中 (图4B)。将标本放至小瓶高度的一半，将标签放于其中。小瓶放于装满液体的广口瓶中，小瓶用塑料纸或棉花塞紧。用针或镊子逼出最后的气泡。用这种方法即使大的震动也不会导致瓶子中标本的损坏。运输时标本瓶应小心放在固定的容器里。保存液可用75%乙醇。
       长期保存标本最好也用大瓶套小瓶的方法，以防止容器不严密而乙醇发挥完后损害到标本。
       研究时标本可放在盛有75%乙醇的培养皿中观察和解剖。

标本观察与研究方法

       大部分蜉蝣个体都相对较大，外生殖器位于体外，较易观察。但观察较小的个体和研究翅脉时，还需要制作玻片标本。
       常用的方法为：标本用无水乙醇脱水2-3次后，放入二甲苯中透明，加拿大树胶封片后即可观察。
       绘图用常规的九宫格法。对于玻片标本，用幻灯机投影放大后画出轮廊，再在解剖镜下观察，画好细节。
       现在有越来越多的、越来越高级的数码摄像设备、微距镜头和图像处理软件应用到蜉蝣观察、绘图和研究中来。它们极大地提高了研究效率和图像质量及其客观性、可视性。

致谢

本文获得国家自然科学基金项目(No. 31172124, 31472023)、国家科技基础条件平台工作重点项目(No. 2005DKA21402)、国家自然科学基金委员会应急管理项目(No.31750002)的资助！

参考文献

1. 周长发，苏翠荣，归鸿. (2015). 中国蜉蝣概述. 科学出版社. 北京. ISBN: 9787030446749.
2. 周长发，赵强，高伟，戴建华，孙红英. (2010). 野外常见动物图鉴——山地动物学野外实习指导图册. 高等教育出版社. 北京. ISBN: 9787040305258.
3. Edmunds, G. F. Jr., Jensen, S. L. and Berner, L. (1976). The mayflies of North and Central America. University of Minnesota Press. Minneapolis. USA. ISBN: 0816607591.