Interaction Analysis Between Nucleic and Protein Using SPR Technology

材料与试剂

1. 无盖1.5 ml EP管（Cytiva，货号：BR-1002-87）
2. 96孔板（Cytiva，货号：BR-1005-03）
3. 96孔板封口膜（Cytiva，货号：28-9758-16）
4. S系列SA芯片（Cytiva，货号：29-1049-92（一片装）/BR-1005-31（三片装）)
5. 缓冲液：10x HBS-EP+ （Cytiva，货号：BR-1006-69）
6. 去离子水（用0.22 μm膜过滤）。
7. 生物素化修饰的核酸配体Lac O1：商业化合成的粉末，用水稀释到100 μg/ml，分装保存在-20 °C。对合成的核酸需要确认碱基组成和核酸的完整性，以及生物素化修饰的比例和纯度（本实验使用的生物素化修饰核酸由金唯智生物技术有限公司合成）。注：核酸的空间二级或三级结构可能对分析物的结合是至关重要的（如 DNA、RNA适配体，双链DNA等），需要采用加热变性和缓慢冷却复性来保证核酸的结合活性。
8. Lac I蛋白分析物：母液浓度至少为10 μM，样品体积在50 μl以上，纯度>90%。（Novoprotein, #CG57）在选择蛋白供应商时，客户需要确认蛋白的活性，如需脱盐，可选择PD MiniTrapTM G-25（Cytiva，货号28-9180-07）或PD-10 Desalting（Cytiva，货号17-0851-01）。
   

仪器设备

1. Biacore T200生物分子相互作用系统（Cytiva，货号：28975001）

实验步骤

一、仪器准备

1. 开机操作
   1.1

   打开Biacore T200系统和电脑的电源开关。Biacore T200的电源开关位于系统背面的左下角。开机后，需等待检测单元的温度达到预设温度（用户自设，通常为25 °C）。待温度稳定后，面板上的温度指示灯（黄色）会停止闪烁，该过程可能需要30-60分钟。
   1.2

   打开Biacore T200 控制软件（Start→Program→Biacore→Biacore T200 Control Software），运行后软件程序会自动和主机系统建立连接。
   1.3

   准备运行缓冲液。量取50 ml 10 x HBS-EP+ buffer、450 ml去离子水（已经0.22 μm膜过滤），混匀后放入500 ml 缓冲液瓶。
2. 运行缓冲液的放置
   2.1

   将已经配制好的运行缓冲液放在T200系统左侧的缓冲液托架上，换上黑色的单孔盖。
   2.2

   将缓冲液进液管A（注意软管上的蓝色标签）插入至缓冲液瓶底部。其余三根进液管（B、C和D）放在左侧的舱门后。
   2.3

   将2 L的废液瓶放置在T200系统右侧的缓冲液托架上，连接上专用的盖子。
   2.4

   取500 ml 去离子水装入500 ml 缓冲液瓶，放置在右侧缓冲液托架上用于清洗进样针。
3. 芯片的放置
   3.1

   点击工具条中的 按钮或选择Tools菜单中的Insert Chip选项，打开芯片舱门。
   3.2

   如果已经有芯片在芯片舱内，点击工具条中的按钮或选择Tools菜单中的Eject Chip选项。
   
   
   
   
   3.3

   如果使用的是新芯片，选择New Chip。在Chip Type的下拉菜单中选择对应的芯片种类（此实验为SA芯片），在Chip Id中填入和芯片相关的实验信息，Chip lot No. 中可填入芯片批号（选填）。如果是已经使用过的芯片，请选择Reuse Chip，并在Chip Id下拉菜单中找到与之相对应的芯片信息。
   
   
   
   
   3.4

   手持芯片，有字的一面朝上。按照芯片上的箭头方向，将芯片轻轻推入卡槽，最后合上芯片舱的舱门。
   
   
   
   
   3.5

   点击Dock Chip按钮，芯片置入后系统将自动转入待机（Standby）状态。
   3.6

   选择Tools→Prime命令，点击Start。缓冲液会以较高的流速冲洗整个内部的流路系统，整个过程耗时6-7分钟。结束后，点击Close，系统自动转入待机（Standby）状态。注意：当系统更换缓冲液或者芯片后，必须运行Prime程序。Prime时缓冲液会冲洗整个流路系统，为下一步的实验做好准备。
4. 放置试管架
   4.1

   Biacore T200有三种不同的试管架供用户使用：Reagent Rack 1、Reagent Rack 2（图A）和Sample and Reagent Rack1（图B），见下图。 
   
   
   图A：Reagent Rack 1&2（左1右2）图B: Sample and Reagent Rack1
   
   Reagent Rack 1&2通常和96/384微孔板配合使用，加装在指定的试管架底座上。具体的组装方式参见下图。
   
   
   Reagent Rack 1&2和96/384微孔板安装方式
   
   本次实验中使用Sample and Reagent Rack1。
   
   4.2

   点击工具栏 →按钮，或选择Tool→Eject
   4.3

   用手指将试管架下方的金属按键向里侧按（见下图中白色箭头），试管架将会解除锁定并弹出，然后可以轻轻抽出试管架。
   
   
   试管架的取出方式
   
   
   4.4

   按住试管架右侧的黑色按钮，向左侧打开金属盖。放入相应的试管后，轻轻合上金属盖。听到“咔”声，表明金属盖已经处于锁定状态。
   4.5

   将试管架沿着卡槽轻轻推入样品舱，听到“咔”声，表明试管架已经处于正确位置并锁定。
   
   
   试管架的放入方式
   
   
   4.6

   点击Eject Rack Tray对话框中的OK，试管架会被自动送入样品舱，舱门也会自动合上。注意：样品舱舱门打开后会有时间限制，打开60秒后舱门将自动合上。最后15秒时，对话框中的倒数计时会显示为红色字体并闪烁。此时请不要强行将试管架放入，以免夹到手。可以等待舱门合上后，重新打开即可。

1. 运行缓冲液：本实验缓冲液选用的是HBS-EP+，将10× HBS-EP+ (pH 7.4)用去离子水稀释10倍，至少配制200 mL。根据实验不同调整缓冲液的配制量。
2. Condition 缓冲液：含50 mM NaOH, 1 M NaCl；至少配制1 ml。
   根据核酸配体与蛋白分析物的分子量，按1:1的结合比例，Rmax≦100，计算获得配体Lac O1的实际偶联量应≦55 RU。
3. 核酸配体浓度：用运行缓冲液HBS-EP+ 将Lac O1溶液稀释至0.125 μg/ml，100 μl（至少保证1:20的稀释比）。
   将稀释后的配体溶液置于95 °C加热块中变性10 min，随后置于室温，自然冷却复性，有利于DNA双链结构的形成。
4. 分析物浓度：用运行缓冲液将Lac I蛋白浓度梯度稀释至：20 nM, 10 nM, 5 nM, 2.5 nM, 1.25 nM, 0.625 nM。

本实验选用多循环检测（multi-cycle kinetics）

1. 配体偶联
   1.1

   打开Biacore T200 Control Software，点击Run，选择Manual Run。弹出的对话框中，Flow rate填写10 μl/min，在Flow path中勾选Flow path 2或4。
   
   
   
   
   
   
   1.2

   在右侧下拉菜单中选用Sample and Reagent Rack 1，点击Eject Rack，系统会自动退出样品架。准备足够体积的样品（如果使用的是带盖的EP管，所有盖子必须剪去）。1 ml Condition缓冲液放入R1D1，100 μl 配体溶液放入R1E1。盖上试管架盖子，将样品架送回样品舱，点击Start。
   1.3

   保存method与result文件到指定路径的文件夹，系统正式运行手动偶联程序。点击，样品孔选择R1D1，进样时间为60 s；同样条件连续进样三次，随后点击，时间为60 s。仪器按照程序设置，执行SA芯片表面的condition处理，如下图：
   
   
   
   
   1.4

   由于生物素和SA的亲和力非常高，SA芯片的配体固定尽量以低流速、短时间进样，从而避免配体固定水平超过预期所需的固定量。点击，流速调整为5 μl/min；点击，样品孔选择R1E1，配体进样时间为30s。根据配体的实际固定水平选择是否需要增加进样步骤。若达到目标偶联量，点击，终止配体固定程序。
   1.5

   本次实验的配体Lac O1 实际偶联量为25.7 RU。
   
   
   
   
2. 在打开的Biacore T200 Control Software里点开file中的Open/New Wizard Template。
   
   
   
   
3. 在Open/New Wizard Template的左边目标栏里点中Kinetics/Affinity后双击。
   
   
   
   
4. 在Kinetics/Affinity-Injection Sequence界面中，Flow path选择2-1或4-3，Chip type选择SA，接着点NEXT。
   
   
   
   
5. 在SA chip-Kinetics-Setup界面里，Startup底下的Solution一栏中填写HBS-EP+，并将Number of cycles选为3，接着点Next。
   
   
   
   
6. 在SA chip-Kinetics-injection Parameters界面下：在Sample一栏中Contact time 为300 s，Flow rate 为30 μl/min， Dissociation time 为600 s；在Regeneration一栏中，再生溶液为0.5% SDS，Contact time 为30 s，Flow rate 为30 μl/min， Stabilization period为60 s，接着点Next。
   
   
   
   
7. 在SA chip-Kinetics--Sample界面中，填写分析物信息：Sample id填写样品名称Lac I，MW(Da)填写分子量39,400， 第一个Concentration为摩尔浓度将其调为nM，第二个为质量浓度，摩尔浓度填完后质量浓度会自动计算（每个样品请选择一个浓度进行重复进样，样品浓度由低到高填写）。接着点Next。
   
   
   
   
8. 样品舱和芯片舱的温度均设为25 °C，点击Next。
   
   
   
   
9. 在SA chip-kinetics-Rack Position界面，将Reagent Rack改为Sample and Reagent Rack1。
   
   
   
   点开Menu后选Automatic Positioning，进入下面界面后，将Pooling 一栏全部改为Yes，Vial Size根据需求进行调整，1.5 ml EP管请选择Medium。
   
   
   
   
10. 根据样品所在位置和用量进行样品准备和放置，随后点击Next，确认运行缓冲液的体积达到实验所需。点击Start，对实验方法进行保存，再对数据结果进行保存，仪器便会开始自动运行。
    
    
    

结果与分析

1. 打开数据分析软件Biacore T200 Evaluation Software，点File 中的Open找到对应的数据文件。
   
   
   
   
2. 接着点击Kinetics/Affinity，在下拉栏里点击Surface bound。
   
   
   
   
3. 在Kinetics/Affinity-Select Curves界面的Select evaluation mode下面选择Single mode；在Curve一栏中Sample的下拉栏中可以选择待分析的样品。如果哪个浓度的样品检测结果出现问题，可以在样品浓度表格中将此浓度前的对号去掉，删除此浓度进入分析。接着点Next。
   
   
   
   
4. 在接下来的界面中点Kinetics。
   
   
   
   
5. Model选择1:1 Binding，接着点击Fit进行数据拟合。拟合结束后，显示如下界面：
   
   
   
   
6. 在数据显示栏里，Quality Control 的前三项都亮绿灯表示检测数据好，如果亮黄灯表示数据能接受，如果亮红灯说明检测数据超过机器的检测限，需要调整优化实验。本实验的Quality Control 都亮绿灯，说明获得的数据质量好，检测分析通过。
   
   
   
   
7. 数据显示栏的Report 中显示具体的分析数据，包括动力学数据k_a、k_d，亲和力数据K_D，以及Chi²值等。由本实验的分析数据可知，乳糖操纵序列（Lac O1）与乳糖操纵阻抑蛋白（Lac I）结合的k_a值为3.771×10⁶ M^-1s^-1， k_d值为7.602×10^-4 s^-1，K_D值为2.016×10^-10 M。
   
   
   

参考文献

1. Kalodimos, C. G., Bonvin, A. M., Salinas, R. K., Wechselberger, R., Boelens, R. and Kaptein, R. (2002). Plasticity in protein-DNA recognition: lac repressor interacts with its natural operator 01 through alternative conformations of its DNA-binding domain. Embo J 21(12): 2866-2876.