Fishing Interactive Molecular Using SPR Technology

材料与试剂

1. 无盖1.5 ml EP管（Cytiva，货号：BR-1002-87）
2. 4.0 ml 玻璃瓶（Cytiva，货号：BR-1002-09）
3. 橡胶瓶盖2型（Cytiva，货号： BR-1004-11）
4. S系列CM5芯片（Cytiva，货号：29-1049-88（一片装），BR-1005-30（三片装），29-1496-03（十片装））
5. 缓冲液：10x HBS-EP+ （Cytiva，货号：BR-1006-69）
6. 去离子水（0.22 μm膜过滤）。
7. Bait蛋白：如果为商业化蛋白粉末，用水稀释到200 μg/ml，分装在-20 °C保存。客户需要确定蛋白的活性，在进行溶解时，确保溶解液不含Tris等带有伯氨基团的成分。
   

仪器设备

1. Biacore T200生物分子相互作用系统 (Cytiva，货号：28975001)

实验步骤

一、仪器准备

1. 开机操作
   1.1

   打开Biacore T200系统和电脑的电源开关。Biacore T200的电源开关位于系统背面的左下角。开机后，需等待检测单元的温度达到预设温度（用户自设，通常为25 °C）。待温度稳定后，面板上的温度指示灯（黄色）会停止闪烁，该过程可能需要30-60分钟。
   1.2

   打开Biacore T200 控制软件（Start→Program→Biacore→Biacore T200 Control Software），运行后软件程序会自动和主机系统建立连接。
   1.3

   准备运行缓冲液。量取50 ml 10 x HBS-EP + buffer、450 ml 去离子水（已经0.22 μm膜过滤），混匀后放入500 ml 缓冲液瓶。
2. 缓冲液的放置
   2.1

   将已配制好的缓冲液放在T200系统左侧的缓冲液托架上，换上黑色的单孔盖。
   2.2

   将缓冲液进液管A（注意软管上的蓝色标签）插入至缓冲液瓶底部。其余三根进液管（B、C和D）放在左侧的舱门后。
   2.3

   将2 L的废液瓶放置在T200系统右侧的缓冲液托架上，连接上专用的盖子。
   2.4

   取500 ml 去离子水装入500 ml 缓冲液瓶，放置在右侧缓冲液托架上用于清洗进样针。
3. 芯片的放置
   3.1

   点击工具条中的按钮或选择Tools菜单中的Insert Chip选项，打开芯片舱门。
   3.2

   如果已经有芯片在芯片舱内，点击工具条中的按钮或选择Tools菜单中的Eject Chip选项。
   
   
   
   
   3.3

   如果使用的是新芯片，选择New Chip。在Chip Type的下拉菜单中选择对应的芯片种类（此实验为CM5芯片），在Chip Id中填入和芯片相关的实验信息，Chip lot No.中可填入芯片批号（选填）。如果是已经使用过的芯片，请选择Reuse Chip，并在Chip Id下拉菜单中找到与之相对应的芯片信息。
   
   
   
   
   3.4

   手持芯片，有字的一面朝上。按照芯片上的箭头方向，将芯片轻轻推入卡槽，最后合上芯片舱的舱门。
   
   
   
   
   3.5

   点击Dock Chip按钮，芯片置入后系统将自动转入待机（Standby）状态。
   3.6

   选择Tools→Prime命令，点击Start。缓冲液会以较高的流速冲洗整个内部的流路系统，整个过程耗时6-7分钟。结束后，点击Close，系统自动转入待机（Standby）状态。注意：当系统更换缓冲液或者芯片后，必须运行Prime程序。Prime时缓冲液会冲洗整个流路系统，为下一步的实验做好准备。
4. 放置试管架
   4.1

   Biacore T200有三种不同的试管架供用户使用：Reagent Rack 1、Reagent Rack 2（图A）和Sample and Reagent Rack1（图B），见下图。
   
   
   图A：Reagent Rack 1&2（左1右2）图B: Sample and Reagent Rack1
   
   垂钓实验中使用Sample and Reagent Rack1。
   4.2

   点击工具栏按钮，或选择Tool→Eject Rack，样品舱舱门会自动打开。
   4.3

   用手指将试管架下方的金属按键向里侧按（见下图中白色箭头），试管架将会解除锁定并弹出，然后可以轻轻抽出试管架。
   
   
   试管架的取出方式
   
   
   4.4

   按住试管架右侧的黑色按钮，向左侧打开金属盖。放入相应的试管后，轻轻合上金属盖。听到“咔”声，表明金属盖已经处于锁定状态。
   4.5

   将试管架沿着卡槽轻轻推入样品舱，听到“咔”声，表明试管架已经处于正确位置并锁定。
   
   
   试管架的放入方式
   
   
   4.6

   点击Eject Rack Tray对话框中的OK，试管架会被自动送入样品舱，舱门也会自动合上。注意：样品舱舱门打开后会有时间限制，打开60秒后舱门将自动合上。最后15秒时，对话框中的倒数计时会显示为红色字体并闪烁。此时请不要强行将试管架放入，以免夹到手。可以等待舱门合上后，重新打开即可。

1. 运行缓冲液：本实验缓冲液选用的是HBS-EP，将10× HBS-EP稀释10倍，至少配置500 ml 的运行缓冲液，根据实验不同调整缓冲液的配置量。
2. 配体浓度：用醋酸钠将配体溶液稀释至20 μg/ml，200 μl（至少保证1：10的稀释比）。醋酸钠最适pH需根据预富集实验确定。

1. 配体偶联
   1.1

   打开Biacore T200 Control Software，点击File下面的Open/New wizard template，选择immobilization。对话框中，在Chip type中选CM5，在Flow cells per cycle选4，仪器一次偶联4个通道。勾选Flow cell 1,2,3,4, method 选用amine氨基偶联，ligand输入配体名称，该实验选用specify contact time and flow rate，contact time 输入420s（垂钓实验需要高偶联，可延长进样时间提高偶联量），流速一般设为10 μl/min。接着按Next，勾选Prime before run，选择实验温度，一般默认25 °C。
   
   
   
   
   1.2

   在左侧下拉菜单中选用Sample and Reagent Rack 1，系统会自动排好样品放置位置（可以通过鼠标拖拽重新安排）。根据样品架位置表，准备足够体积的样品（如果使用的是带盖的EP管，所有盖子必须剪去）。100 μl 的EDC放入R1D1，100 μl 的NHS放入R1D2，空管放入R1D3，140 μl 乙醇胺放入R1D 4，138 μl 20 μg/ml配体蛋白放入R1D5。盖上试管架盖子，将样品架送回样品舱。
   
   
   
   
   1.3

   点击Next，弹出Prepare Run Protocol对话框，确认运行缓冲液体积大于表中的最低要求，点击start。
   
   
   
   
   1.4

   保存method与result文件到文件夹。系统正式自动运行偶联程序，整个过程耗时约40 min。软件自动生成偶联结果，建议最终偶联量大于10000 RU。
   
   
   
   
2. 在打开的Biacore T200 Control Software里点开File中的Open/New Method。
   
   
   
   
3. 在Biacore Methods里双击Inject and recover。
   
   
   
   
4. 在Method Builder界面中，Overview和General Setting无需修改，点Assay Steps里的Inject and Recover，修改number ofreplicates，推荐10-20次以便收集到足够量的样品进行质谱检测。
   
   
   
   
5. 在Cycle Types界面里，Inject and Recover，首次实验推荐使用默认参数，后期可以根据样品情况调整contact time, flow rate，incubation time等，wash solution和recovery solution默认为0.5% TFA，也可以根据样品情况使用0.2%-1%TFA， 甲酸，乙酸或再生溶液等。Deposition solution为50 mM NH₄HCO3。若使用的是非酸性washsolution，Deposition solution 可以取消或用runningbuffer代替。
   
   
   
   
6. 点击Setup Run，Flowpath选择1,2,3,4，点Next。勾选Prime before run，默认实验温度为25 °C。
   
   
   
   
7. 点Next进入Rack Position界面，Reagent Rack默认为Sample and Reagent Rack1。
   
   
   
   点开Menu后选Automatic Positioning进入下面界面后，将Pooling 一栏全部改为Yes，Vial Size根据需求进行调整，调整后样品放置图如下。
   
   
   
   
8. 根据样品所在位置进行样品准备和放置。D1放置290 μl 的NH₄HCO₃，浅绿色D2-D11均放置空的1.5 ml EP管，F1-F3 放置4.0 ml 的玻璃瓶，分别装入1,350 μl 样品，3,321 μl 0.5% TFA, 1,610 μl 0.5% TFA。点Next后，对方法进行保存，再对数据路径进行保存，仪器便会开始自动运行，candidate被回收到空的EP管中。
   
9. 合并所有EP管中回收到的样品，送质谱。
   
10. 对照组实验：用一张新的CM5芯片，不做配体偶联，直接在空白CM5芯片上进行Injectandrecover，垂钓的实验操作与参数同实验组，回收到的样品作为negative control打质谱。
    

结果与分析

1. 打开数据分析软件Biacore T200 Evaluation Software，点File 中的Open找到文件。
   
   
   
   
2. 接着点All sensorgrams。每个cycle 重复5次，每次均做一次结合与回收，每次都能结合并回收到candidate。
   
   
   
   
3. 质谱结果，表征垂钓出的物质结构。
   
   
   对照组样品质谱结果，有很多信号峰
   
   
   实验组垂钓后的样品质谱结果，只有一个信号峰