Interaction Analysis Between Protein and Small Molecular Using SPR Technology

材料与试剂

1. 无盖1.5 ml EP管（Cytiva,货号：BR-1002-87）
2. 橡胶瓶盖2型（Cytiva,货号：BR-1004-11）
3. 96孔板（Cytiva,货号：BR-1005-03）
4. 96孔板封口膜（Cytiva,货号：28-9758-16）
5. S系列CM5芯片（Cytiva，货号：29-1049-88（一片装），BR-1005-30（三片装），29-1496-03（十片装））
6. 氨基偶联试剂盒（Cytiva, 货号：BR-1000-50）
7. 缓冲液：10x PBS-P+ （Cytiva,货号：28-9950-84）
8. 分析纯 DMSO，去离子水（0.22 μm膜过滤）。
9. 蛋白：浓度一般需大于 200 μg/ml。客户需确定蛋白活性，确保不含 Tris 等带有伯氨基团的成分。如需脱盐， 可选择PD MiniTrapTM G-25（Cytiva,货号：28-9180-07）或 PD-10 Desalting（Cytiva,货号：17-0851-01）。
10. 小分子：母液浓度建议大于10 mM，体积在50 μL以上，纯度>90%，溶在100%DMSO里。如含有咪唑、蔗糖、甘油等高折光率物质，需进行脱盐处理。
    

仪器设备

1. Biacore S200生物分子相互作用系统 (Cytiva，货号：29136649)

实验步骤

一、仪器准备

1. 开机操作
   1.1

   打开 Biacore S200 系统和电脑的电源开关。Biacore S200 的电源开关位于系统背面的左下角。开机后，需等待检测单元的温度达到预设温度（用户自设，通常为25 °C）。待温度稳定后，面板上的温度指示灯（黄色）会停止闪烁，该过程可能需要 30-60 分钟。
   
   1.2

   打开 Biacore S200 Control Software，运行后软件程序会自动和主机系统建立连接
   1.3

   准备偶联步骤的运行缓冲液。量取 20 ml 10 x PBS-P+ buffer、180 ml 去离子水（已经0.22 μm膜过滤），混匀后放入缓冲液瓶。
2. 缓冲液的放置
   2.1

   将已经配制好的缓冲液放在 S200系统左侧的缓冲液托架上，换上黑色的单孔盖。
   2.2

   将缓冲液进液管 A （注意软管上的蓝色标签）插入至缓冲液瓶底部。其余三根进液管（B、C和D）放在左侧的舱门后。
   2.3

   将 2 L 的废液瓶放置在S200系统右侧的缓冲液托架上，连接上专用的盖子。
   2.4

   取 500 ml 去离子水装入 500 ml 缓冲液瓶，放置在右侧缓冲液托架上用于清洗进样针。
3. 芯片的放置
   3.1

   选择 Tools 菜单中的 Eject Chip 选项，打开芯片舱门进行芯片更换。
   
   
   
   
   3.2

   如果使用的是新芯片，选择 New Chip。在 Chip Type 的下拉菜单中选择对应的芯片种类（此实验为 CM5 芯片），在 Chip Id 中填入和芯片相关的实验信息，Chip lot No. 中可填入芯片批号（选填）。如果是已经使用过的芯片，请选择Reuse Chip，并在 Chip Id 下拉菜单中找到与之相对应的芯片信息。
   
   
   
   
   3.3

   手持芯片，有字的一面朝上。按照芯片上的箭头方向，将芯片轻轻推入卡槽，最后合上芯片舱的舱门。
   
   
   
   
   3.4

   点击 Dock Chip 按钮，芯片置入后系统将自动转入待机（Standby）状态。
   3.5

   选择 Tools→Prime 命令，点击 Start。缓冲液会以较高的流速冲洗整个内部的流路系统，整个过程耗时 6-7分钟。结束后，点击Close，系统自动转入待机（Standby）状态。注意：当系统更换缓冲液或者芯片后，必须运行 Prime程序。Prime 时缓冲液会冲洗整个流路系统，为下一步的实验做好准备。
4. 放置试管架 
   4.1

   Biacore S200 有三种不同的试管架供用户使用： 
   Reagent Rack 1、Reagent Rack 2（图A）和 Sample and Reagent Rack1（图B），见下图。
   
   
   图A：Reagent Rack 1&2（左1右2）图B: Sample and Reagent Rack1
   
   Reagent Rack 1&2 通常和 96/384 微孔板配合使用，加装在指定的试管架底座上。具体的组装方式参见下图。
   
   
   Reagent Rack 1&2和96/384微孔板安装方式
   
   本次实验中使用 Sample and Reagent Rack1。
   
   4.2

   点击工具栏按钮，或选择 Tool→Eject Rack，样品舱舱门会自动打开。
   4.3

   用手指将试管架下方的金属按键向里侧按（见下图中白色箭头），试管架将会解除锁定并弹出，然后可以轻轻抽出试管架。
   
   
   试管架的取出方式
   
   
   4.4

   按住试管架右侧的黑色按钮，向左侧打开金属盖。放入相应的试管后，轻轻合上金属盖。听到“咔”声，表明金属 盖已经处于锁定状态。
   4.5

   将试管架沿着卡槽轻轻推入样品舱，听到“咔”声，表明试管架已经处于正确位置并锁定。
   
   
   试管架的放入方式
   
   
   4.6

   点击 Eject Rack Tray 对话框中的 OK，试管架会被自动送入样品舱，舱门也会自动合上。注意：样品舱舱门打开后会有时间限制，打开 60 秒后舱门将自动合上。最后 15 秒时，对话框中的倒数计时会显示为红色字体并闪烁。此时请不要强行将试管架放入，以免夹到手。可以等待舱门合上后，重新打开即可。

1. 偶联缓冲液选用的是 PBS-P+，将 10× PBS-P+ pH 7.4 稀释 10 倍，配置 200 ml 的运行缓冲液。
2. 偶联量计算
   根据以下公式可计算目标偶联量
   
   
   
   其中，R_max 为芯片表面最大结合容量，在小分子测试中通常代入 100 RU。analyte MW 和 ligand MW 分别为小分子和蛋白的分子量，S_m 为化学计量比，未知时选择1。R_l 为配体偶联水平。实验时实际偶联量为 1.5 倍的 R_l。所以经计算， Rl 为 5,000 RU，该蛋白的目标偶联量为 7,500 RU。也可以选择 contact time 模式进样实现高偶联。
3. 配体预富集
   蛋白用醋酸钠 pH 5.5, 5.0, 4.5，4.0 分别稀释到 10 μg/ml，各准备 100 μl，通过预富集实验，确定 pH 5.0 作为最佳偶联条件。故用 pH 5.0 的醋酸钠将配体溶液稀释至 10 μg/ml，200 μl 进行正式的偶联操作。
4. 配体偶联
   4.1

   打开 Biacore S200 Control Software, 点击 Template 下面的 surface preparation，选择 Immobilization。
   
   
   
   在 Chip type中选 CM5，Flow cells per cycle 选1。勾选 Flow cell 2，method 选用 amine 氨基偶联，ligand 输入配体名称，该实验选用 specify contact time and flow rate，contact time 输入 420 s （视样品情况不同而定，可延长进样时间提高偶联量），流速一般设为10 μl/min。接着 Next ，勾选 Prime before run，选择实验温度，一般默认 25 °C。
   
   
   
   
   
   
   4.2

   在左侧下拉菜单中选用 Sample and Reagent Rack 1，系统会自动排好样品放置位置（可以通过鼠标拖拽重新安排）。根据样品架位置表，准备足够体积的样品（如果使用的是带盖的EP管，所有盖子必须剪去）。100 μl 的 EDC 放入 R1D1， 100 μl 的 NHS 放入 R1D2， 140 μl 乙醇胺放入 R1D3，108 μl 20 μg/ml 配体蛋白放入 R1D4，空管放入 R1D5。盖上试管架盖子，将样品架送回样品舱。
   
   
   
   
   4.3

   点击 Next，弹出 Prepare Run Protocol 对话框，确认运行缓冲液体积大于表中的最低要求，点击Start。
   
   
   
   
   4.4

   保存 method 与 result 文件到文件夹。系统正式自动运行偶联程序，整个过程耗时约 30 min。
   4.5

   软件自动生成偶联结果，本次实验偶联量约为 6,300RU。
   
   
   

1. 配置运行缓冲液和溶剂校正曲线
   小分子样品的运行缓冲液选用含 5% DMSO 的 PBS-P+（视样品溶解性可调整 DMSO 含量，最高耐受 10%）
   取 52.5 ml 10× PBS-P 用去离子水稀释到 500 ml，配成 1.05x PBS-P。按照如下表格比例，加入 DMSO配置 5% DMSO运行缓冲液和溶剂校正母液。
   
   
   
   按照如下表格混合 4.5% 和 5.8% 母液配置 5%DMSO 浓度校正曲线
   
   
   
   
2. 小分子样品准备
   用 1.05x PBS-P 稀释 10 mM小分子母液20倍，得到 500 μM 在 5% DMSO 中的小分子，之后用配好的 5% DMSO 运行缓冲液将分析物浓度稀释到 5 μM 作为最高进样浓度，向下对半稀释至少 5 个浓度梯度，例如 2.5 μM, 1.25 μM，0.625 μM, 0.3125 μM, 0.156 μM（根据实际样品亲和力强弱进行浓度梯度调整）。间隔设置一个重复浓度，增加一个 0 浓度。
   
   
   
   
3. 本实验选用多循环检测（multi-cycle kinetics），在打开的 Biacore S200 Control Software 里点开 Template 中的 Kinetics/affinity，然后双击打开 Fragment/LMW 下的 LMW kinetics/affinity multi-cycle。
   
   
   
   
4. 在 General Settings 界面，可以修改浓度单位、样品仓温度、数据采集频率等条件，在此我们将 concentration unit改为μM。
   
   
   
   
5. 在 Assay Steps 界面，可以调整检测项目和重复次数。例如在 number of replicates 修改 Startup 和 sample 的重复次数， 修改检测温度等。如无 control sample，可在此页面将其删除。
   
   
   
   
6. 在 Cycle Types 界面下，Sample 一栏中可以修改结合解离时间、流速等进样参数。因本实验样品小分子亲和力较强， 故 Contact time 修改为 120 s，Flow rate 为 20 μl/min，Dissociation time 为 300 s。通常小分子无需再生。其他项无需做修改。 Extra wash 用 50% DMSO 以清除管路中残留的小分子（extra wash 不流经芯片表面，不会影响配体活性）。
   
   
   
   
7. 点击 verification，如果方法有问题在这个页面会报错。如果没问题，点击 setup Run。在 detection界面选择要使用的 flow path，这里选用 2-1。
   
   
   
   
8. 点击 next，进入分析物信息填写。Startup 填写buffer即可，Sample solution 填写样品名称，MW(Da) 填写分子量，Conc 填写进样浓度（选择一个浓度进行重复进样，样品浓度由低到高填写）。接着点 Next。以 103 为例进行填写如下：
   
   
   
   
9. 点击 Next 进入 Rack Position 界面，将 Reagent Rack 改为 Sample and Reagent Rack1。
   
   
   
   点开 Menu 后选 Automatic Positioning 进入下面界面后，将 Pooling 一栏全部改为 Yes，Vial Size 根据需求进行调整， 1.5 ml EP 管请选择 medium。
   
   
   
   
10. 根据样品所在位置进行样品准备和放置，盖好橡胶瓶盖防止挥发。点 Next 后，对方法和数据进行保存，仪器便会开始自动运行。

结果与分析

1. 打开数据分析软件 Biacore S200 Evaluation Software，点 Data 中的 open 找到文件。
   
   
   
   
2. 首先点 solvent correction 进行溶剂校正分析。溶剂校正曲线一般要求落在 -500 到 +1000 RU，Chi2 小于 2。如果超出此范围较多，多由于 DMSO 浓度配置不准确造成。
   
   
   
   
3. 点 Evaluation 下的 Kinetics 或者 Affinity 进行拟合。小分子因亲和力较弱，多数没有动力学曲线，因此常选用 Affinity拟合。亲和力较强有动力学曲线的小分子可选用 kinetics 模型拟合。
   
   
   
   然后选择要分析的样品，点 next，在 Included Curves 可以选择待分析的样品浓度。如果哪个浓度的样品检测的结果不合适，可以将此浓度前的对号勾掉，以删除此浓度。
   
   
   
   
4. 接着点左上角的Fit即可得到拟合结果。经拟合，该小分子与蛋白的亲和力K_D=9x10^-7M。对于亲和力拟合，K_D需落在样品浓度范围内。