Interaction Analysis Between Protein and Protein Using SPR Technology

材料与试剂

1. 无盖1.5 ml EP管（Cytiva，货号：BR-1002-87）
2. S系列CM5芯片 (Cytiva，货号：29-1049-88（一片装）/BR-1005-30（三片装）/29-1496-03（十片装）)
3. 氨基偶联试剂盒（Cytiva，货号：BR-1000-50）
4. 缓冲液：10x HBS-EP+ （Cytiva，货号：BR-1006-69）
5. 去离子水（用0.22 μm膜过滤）。
6. 配体蛋白A：如果为商业化蛋白粉末，用水稀释到 200 μg/ml，分装在 -20 °C 保存。客户需要确定蛋白的活性，在进行溶解时，确保溶解液不含 Tris 等带有伯氨基团的成分。
7. 流动相蛋白B：母液浓度为 1 mM，样品体积在 200 μl 以上，纯度>90%。如需脱盐，可选择的 PD MiniTrapTM G-25（Cytiva，货号： 28-9180-07）或 PD-10 Desalting（Cytiva，货号：17-0851-01）。
8. 再生溶液 Glycine 1.5 （Cytiva，货号：BR-1003-54），Glycine 2.0 （Cytiva，货号：BR-1003-55），Glycine 2.5（Cytiva，货号：BR-1003-56），Glycine 3.0（Cytiva，货号：BR-1003-57）
   

仪器设备

1. Biacore T200生物分子相互作用系统 (Cytiva，货号：28975001)

实验步骤

一、仪器准备

1. 开机操作
   1.1

   打开 Biacore T200 系统和电脑的电源开关。Biacore T200 的电源开关位于系统背面的左下角。开机后，需等待检测单元的温度达到预设温度（用户自设，通常为25 °C）。待温度稳定后，面板上的温度指示灯（黄色）会停止闪烁，该过程可能需要30-60分钟。
   1.2

   打开 Biacore T200 控制软件（Start→Program→Biacore→Biacore T200 Control Software），运行后软件程序会自动和主机系统建立连接。
   1.3

   准备运行缓冲液。量取 50 ml 10x HBS-EP+ buffer、450 ml 去离子水（已经 0.22 μm 膜过滤），混匀后放入 500 ml 缓冲液瓶。
2. 缓冲液的放置
   2.1

   将已经配制好的缓冲液放在T200系统左侧的缓冲液托架上，换上黑色的单孔盖。
   2.2

   将缓冲液进液管A（注意软管上的蓝色标签）插入至缓冲液瓶底部。其余三根进液管（B、C和D）放在左侧的舱门后。
   2.3

   将 2 L 的废液瓶放置在 T200 系统右侧的缓冲液托架上，连接上专用的盖子。
   2.4

   取 500 ml 去离子水装入 500 ml 缓冲液瓶，放置在右侧缓冲液托架上用于清洗进样针。
3. 芯片的放置
   3.1

   点击工具条中的按钮或选择 Tools 菜单中的 Insert Chip 选项，打开芯片舱门。
   3.2

   如果已经有芯片在芯片舱内，点击工具条中的按钮或选择Tools菜单中的Eject Chip 选项。
   
   
   
   
   3.3

   如果使用的是新芯片，选择 New Chip。在 Chip Type 的下拉菜单中选择对应的芯片种类（此实验为 CM5 芯片），在 Chip Id 中填入和芯片相关的实验信息，Chip lot No. 中可填入芯片批号（选填）。如果是已经使用过的芯片，请选择 Reuse Chip，并在 Chip Id 下拉菜单中找到与之相对应的芯片信息。
   
   
   
   
   3.4

   手持芯片，有字的一面朝上。按照芯片上的箭头方向，将芯片轻轻推入卡槽，最后合上芯片舱的舱门。
   
   
   
   
   3.5

   点击 Dock Chip 按钮，芯片置入后系统将自动转入待机（Standby）状态。
   3.6

   选择 Tools→Prime 命令，点击 Start。缓冲液会以较高的流速冲洗整个内部的流路系统，整个过程耗时6-7分钟。结束后，点击 Close，系统自动转入待机（Standby）状态。注意：当系统更换缓冲液或者芯片后，必须运行 Prime 程序。Prime 时缓冲液会冲洗整个流路系统，为下一步的实验做好准备。
4. 放置试管架
   4.1

   Biacore T200有三种不同的试管架供用户使用：Reagent Rack 1、Reagent Rack 2（图A）和 Sample and Reagent Rack1（图B），见下图。
   
   
   图A：Reagent Rack 1&2（左1右2）图B: Sample and Reagent Rack1
   
   Reagent Rack 1&2 通常和96/384微孔板配合使用，加装在指定的试管架底座上。具体的组装方式参见下图。
   
   
   Reagent Rack 1&2和96/384微孔板安装方式
   
   本次实验中使用 Sample and Reagent Rack1。
   
   4.2

   点击工具栏 →按钮，样品舱舱门会自动打开。
   4.3

   用手指将试管架下方的金属按键向里侧按（见下图中白色箭头），试管架将会解除锁定并弹出，然后可以轻轻抽出试管架。
   
   
   试管架的取出方式
   
   
   4.4

   按住试管架右侧的黑色按钮，向左侧打开金属盖。放入相应的试管后，轻轻合上金属盖。听到“咔”声，表明金属盖已经处于锁定状态。
   4.5

   将试管架沿着卡槽轻轻推入样品舱，听到“咔”声，表明试管架已经处于正确位置并锁定。
   
   
   试管架的放入方式
   
   
   4.6

   点击 Eject Rack Tray 对话框中的 OK，试管架会被自动送入样品舱，舱门也会自动合上。注意：样品舱舱门打开后会有时间限制，打开60秒后舱门将自动合上。最后15秒时，对话框中的倒数计时会显示为红色字体并闪烁。此时请不要强行将试管架放入，以免夹到手。可以等待舱门合上后，重新打开即可。

二、配体偶联

1. 偶联缓冲液：本实验缓冲液选用的是 HBS-EP。
2. 偶联量计算
   根据以下公式可计算目标偶联量
   
   
   
   其中，Rmax 为芯片表面最大结合容量，在蛋白测试中通常代入 100 RU。analyte MW 和 ligand MW 分别为蛋白B 和蛋白 A 的分子量，Sm 为化学计量比，未知时选择1。Rl 为配体偶联水平。实验时实际偶联量为1.5倍的 Rl。所以经计算，Rl 为 114 RU，蛋白 A 的目标偶联量为 171 RU。
   注：本实验选用了偶联蛋白 A 流过蛋白 B，客户也可以选择偶联蛋白 B 流过蛋白 A，多数情况下均可。部分情况下只能选用一种实验设计方式，如蛋白等电点过低等情况。（详情请参考 Biacore 培训手册）
3. 配体预富集
   蛋白A用醋酸钠 pH 5.0, 4.5，4.0 分别稀释到 10 μg/ml (至少10倍稀释比)，各准备 100 μl，通过预富集实验，确定pH 4.5作为最佳偶联条件。故用 pH 4.5 的醋酸钠将配体溶液稀释至 10 μg/ml，200 μl 进行正式的偶联操作。
4. 配体偶联
   4.1

   打开 Biacore T200 Control Software , 点击 File 下面的 Open/New wizard template，选择 immobilization。对话框中，在 Chip type 中选 CM5，在 Flow cells per cycle 选1。勾选 Flow cell 2，method 选用 amine 氨基偶联，
   4.2

   Theoretical and applied genetics ligand 输入配体名称，该实验选用 aim for immobilized level，target level 输入计算出的 171 RU。在 Flow path 中选择 Flow path 2（如芯片2通道已用，可选择4通道）。接着按 Next，勾选 prime，选择实验温度，一般默认 25 °C。
   
   
   
   
   
   
   4.3

   在左侧下拉菜单中选用 Sample and Reagent Rack 1，系统会自动排好样品放置位置（可以通过鼠标拖拽重新安排）。根据样品架位置表，准备足够体积的样品（如果使用的是带盖的EP管，所有盖子必须剪去）。100 μl的 EDC 放入 R1D3，100 μl 的 NHS 放入 R1D4，空管放入 R1D5，140 μl 乙醇胺放入 R1D6，166 μl 10 μg/ml 配体蛋白放入 R1D1。盖上试管架盖子，将样品架送回样品舱。
   
   
   
   
   4.4

   点击Next，弹出 Prepare Run Protocol 对话框，确认运行缓冲液体积大于表中的最低要求，点击 Start。
   
   
   
   
   4.5

   保存 method 与 result 文件到文件夹。系统正式自动运行偶联程序，整个过程耗时约30 min。软件自动生成偶联结果，本次实验偶联量为 230 RU。
   
   

三、样品检测过程

1. 在打开的 Biacore T200 Control Software 里点开 file 中的 Open/New Wizard Template。
   
   
   
   
2. 在 Open/New Wizard Template 的左边目标栏里点中 Kinetics/Affinity 后双击。
   
   
   
   
3. 在 Kinetics/Affinity 界面中，将 Flow path 点为2-1或4-3，Chip type 选择CM5。接着点 NEXT。
   
   
   
   
   
   
4. 在 Setup 界面里，Startup 底下的 Solution 一栏中填写 HBS-EP，并将 Number of cycles 改为3，接着点 Next。
   
   
   
   
5. 在 Kinetics/Affinity-injection Parameter 界面下：在 Sample 一栏中 Contact time 为120s，Flow rate 为30 μl/min，Dissociation time 为120 s，再生条件为 Glycine 2.0，再生时间30 s。
   
   
   
   
6. 在 Kinetics/Affinity-Sample 界面中，填写分析物信息：Sample id 填写样品名称，MW(Da) 填写分子量，第一个Concentration 为摩尔浓度将其调为 μM，第二个为质量浓度，摩尔浓度填完后质量浓度会自动计算（每个样品请选择一个浓度进行重复进样，样品浓度由低到高填写）。接着点 Next。以 b 为例进行填写如下：
   
   
   
   
7. 在 Kinetics/Affinity-System Preparations 界面下，直接点 Next 进入 Rack Position 界面，将 Reagent Rack 改为 Sample and Reagent Rack1，点开 Menu 后选 Automatic Positioning。
   
   
   
   进入下面界面后，将 Pooling 一栏全部改为 Yes，Vial Size 根据需求进行调整，1.5 ml EP管请选择 medium。
   
   
   
   
8. 根据样品所在位置进行样品准备和放置。蛋白B用运行缓冲液 HBS-EP 进行倍比稀释。点 Next 后，对方法进行保存，再对数据路径进行保存，仪器便会开始自动运行。
   

结果与分析

1. 打开数据分析软件 Biacore T200 Evaluation Software，点 file 中的 open 找到文件。
   
   
   
   
2. 接着点 Kinetics/Affinity，在下拉栏里点开 Surface bound。
   
   
   
   
3. 在 Kinetics/Affinity-Select Curves 界面的 Select evaluation mode 下面选择 Single mode；在 Curve 一栏中 Sample 的下拉栏中可以选择待分析的样品。如果哪个浓度的样品检测的结果不合适，可以在样品浓度表格中将此浓度前的对号勾掉，以删除次浓度。实验的传感图如下：
   
   
   
   
4. 接着点 Next，在接下来的界面中点 Affinity（如结合曲线有动力学性质则选择 kinetics 进行拟合，分析步骤可参考核酸蛋白或抗原抗体 SOP）。Model 选择1：1 Binding，接着点击Fit进行数据的拟合。拟合结束后，显示如下界面，蛋白A与蛋白B结合的K_D值为1.2×10^-5 M。亲和力拟合K_D值需落在样品浓度范围内。