产品名称：KAPA mRNA HyperPrep建库试剂盒
实验名称：利用转录组测序技术分析线虫突变体纤毛形成和维持的相关基因

研究背景

纤毛和鞭毛是从单细胞藻类到高等动物中保守的膜细胞器。它的形成和维持依赖于微管马达蛋白驱动的双向纤毛运输，同时纤毛功能的失调与许多人类疾病密切相关，统称为纤毛病。尽管目前有许多关于纤毛的调节机制的研究，但是关于它的具体调节机制以及详细的功能还不是特别清楚。为了进一步深入地探讨纤毛的形成和维持过程，我们利用模式生物秀丽隐杆线虫开展了研究。
生物材料：L1时期线虫突变体
起始总RNA量：~300 ng RNA

实验目的

构建线虫相关突变体mRNA文库，以对于线虫纤毛突变体转录组进行分析，为后续的挖掘控制相应表型的基因提供数据支持。
关键词：RNA，二代测序，线虫

实验步骤

一、RNA提取

整个流程参考了Trizol官网上给的RNA提取步骤。
注意事项：规范操作，保持实验台的清洁，使用核酸free的枪头和离心管，戴口罩，每一步都记着加RNA酶抑制剂，尽量防止RNA的降解。

二、建库流程

1)  全实验流程大概需要6 h左右。根据样品的数量，时间会有所不同；
2)  第一次使用前请仔细阅读KAPA mRNA HyperPrep建库试剂盒说明；
3)  确保RNA没有降解；
4)  纯化磁珠请提前拿出来 (避光)，放在室温半小时后使用；
5)  按照说明书进行逐步操作，本文中将不再详述，下文关键步骤的质控进行了举例说明。

1.  检测RNA完整度
   实验之前使用Agilent 2100进行RNA完整度的检测，注意：这一步非常重要，如果RNA浓度比较高的话也可以通过琼脂糖凝胶电泳进行检测 (比较跑胶条带中28s和18s rRNA条带的亮度比值)。由于在我的实验中用到的都是L1时期的线虫，提取出来的RNA总量相对较低，所以我都是用Agilent 2100进行RNA完整度的检测。以下是我的一个样品的2100结果 (图1)。
   
   
   图1. 利用Agilent 2100进行RNA完整度检测结果图
   
   以上结果说明：这是一个可以用于下面进行RNA建库的样品。在该结果中RIN>7代表该RNA样品完整度很好，可以进行下面的实验。
2. mRNA抓取
   该实验过程直接参考说明书及上面的注意事项即可；在我们的实验中，为了提高mRNA抓取的质量，一般会提前半小时把需要用到的磁珠和buffer放在室温进行平衡。
3. mRNA片段化
   由于后续文库的测序是进行双端150 bp测序，在我们的实验中一般会将片段打断在200-300 bp。第一次做的时候参考说明书用94 °C，6 min的条件进行打断，图2是进行文库扩增，纯化之后的Agilent 2100测定结果示意图。
   
   
   图2. RNA打断 6 min后利用Agilent 2100检测RNA结果图
   
   可以看到使用这个条件进行打断的话，我得到的文库大小在250 bp左右。因为我们用到的接头的大小在120 bp，所以在我的实验中参考说明书的条件得到的片段大小在130 bp左右，相对而言是偏小的。在后续实验中，我对这一步进行了调整，使用条件为94 °C，5 min。使用该条件得到的文库如图3。
   
   
   图3. 文库检测结果图
   
   图3显示，我们得到的文库大小在400 bp左右，相当于片段化之后RNA的大小在280 bp左右。因此，在实验过程中，使用该条件进行片段化RNA。
   
4. 文库扩增：
   文库扩增循环数可根据说明书建议进行操作，但由于前面实验过程中样品损失的不同，个人的差异会比较大。在我的实验中中，使用300 ng总量RNA建库的话，我一般采用9个循环数进行扩增。
5. 磁珠纯化文库：
   注意：请提前半小时将纯化用的磁珠放置在室温平衡。

实验结果

用于建库的起始总RNA为300 ng，经9个PCR循环扩增，使用20 μl Tris-Hcl溶解的条件下，得到的文库浓度一般在8 ng/μl左右，是符合测序标准。

用户使用心得

本试剂盒使用简单易操作，末端补平及加A可同时进行。且加A及后续接头的连接可以一管完成，简单方便，非常适用于样品量比较低的样品。
<新用户使用建议>：1) 通读说明书，明确每一步中要用的体积和浓度后再进行试验，同时在下一步实验开始前做好规划，比如在PCR过程中，可以开始准备下一步的反应体系；2) 清洗磁珠时，管子应紧贴磁力架；3) 用乙醇洗涤磁珠的过程中，注意枪头不要碰到磁珠，可能会粘走磁珠；4) 全过程使用进口的EP及PCR管。