实验名称：新型甲基化方法与传统亚硫酸氢盐甲基化方法的测序比较
产品名称：KAPA HyperPrep kit建库试剂盒

[KAPA建库试剂盒在通用方法学中的应用] 下一代测序技术(NGS)，又称为大规模平行测序技术，与一代测序技术相比，其在测序速度以及成本上的优势使得该技术在各个领域得以迅速应用。
        按所测序核酸分子的类型不同，NGS文库类型可分为DNA 文库—全基因组测序 (WGS)、全外显子组测序 (WES), 染色质免疫沉淀测序 (ChIP-seq) ; RNA 文库—全转录组测序, RNA免疫沉淀测序(RIP-seq)。KAPA NGS系列产品可覆盖所有类型文库构建应用。
        Roche KAPA文库制备试剂为通过NGS进行肿瘤研究提供了整套解决方案 (Roche Dialog，罗氏诊断在华推广KAPA NGS新一代测序系列产品完善基因检测解决方案)。KAPA人类基因组DNA定量及QC试剂盒可以在单次检测中同时评估样本量及样本质量，严防谨守助力深度测序；Roche DNA文库构建试剂盒 (KAPA HyperPrep Kit, KAPA HyperPlus Kit) 及RNA文库构建试剂盒 (KAPA RNA HyperPrep Kit) 等试剂盒具有操作极简 (一管到底)，建库快速 (单日内可完成)，文库质量和得率双高等优点；文库定量试剂盒 KAPA Library Quant Kit质量同监，为测序把好最后一道关；而mRNA-capture Kit、RNA-Seq with RiboErase和纯化磁珠对目标核酸分子的富集可有效降低测序成本。这些试剂盒可有效帮助用户获得稳定可靠的测序结果，为后期的科学实验验证及临床研究提供可信的数据依据。 (测序中国, 案例解析： 定向进化的KAPA酶，从困难样本获得高质量NGS数据的“灵魂”)

研究背景

DNA胞嘧啶修饰在很多生物学过程中 (基因表达到发育) 具有重要作用。在以往的研究中, 亚硫酸氢盐测序 (WGBS)是检测DNA修饰如5-甲基胞嘧啶 (5mC) 和5-羟甲基胞嘧啶 (5hmC) 的黄金标准，但是这种强化学处理会导致DNA的降解，从而导致测序文库的复杂度降低。作者 (Liu et al., 2019) 探索了一种新型的检测5mC和5hmC方法—TET辅助吡啶硼烷测序 (TAPS)。

生物材料：mESC细胞

实验目的

使用KAPA HyperPrep kit构建用于亚硫酸氢盐测序 (WGBS) 以及TET辅助吡啶硼烷测序 (TAPS) 的文库，并比较两种建库方式在不同起始量及不同样本条件下的建库结果，以证明TAPS的优势。

关键词：TAPS （TET辅助吡啶硼烷测序），二代测序，5hmC，5mC

创新应用

将该试剂盒应用到了甲基化建库，并评测了不同起始量的文库构建。

实验步骤

1. DNA提取：利用DNA提取试剂盒提取细胞全基因组DNA。
2. DNA 样本预处理：对于WGBS的样本，混入0.5%的非甲基化λ-DNA；对于全基因组TAPS的样本，混入0.5%的甲基化λ-DNA以及0.025%的未变性的spin-in对照。两种样本通过Covaris M220打断仪及Beckman磁珠片段选择，得到200-400 bp片段；对于用于微量TAPS，先用磁珠片段选择后再加入0.25%N5mCNN及N5hmCNN对照。
3. 文库构建：
   3.1

   WGBS
   DNA起始量200 ng，参照KAPA HyperPrep kit建库说明。末端修复、加A尾、接头连接后利用EpiTect Bisulfite Kit (Qiagen) 进行亚硫酸盐处理转化，最终文库经过6个PCR循环扩增，1x磁珠纯化。
   3.2

   全基因组TAPS
   DNA起始量100 ng，末端修复、加A尾、接头连接后用mTet1CD氧化两次，用吡啶硼烷还原。最终文库经过5个PCR循环扩增，1x磁珠纯化。
   3.3

   微量全基因组TAPS
   起始DNA量分别为100 ng，10 ng，1 ng三个水平。末端修复、加A尾、接头连接后用mTet1CD氧化两次，用吡啶硼烷还原。最终文库经过5个 (100 ng)，8个 (10 ng)，13个(1 ng) PCR循环扩增，1x磁珠纯化。
   3.4

   cfDNA TAPS
   cfDNA起始量为10 ng，1 ng两个。末端修复、加A尾、接头连接后用mTet1CD氧化两次，用吡啶硼烷还原。最终文库经过7个 (10 ng)，13个 (1 ng) PCR循环，1x磁珠纯化。
4. 测序：通过NextSeq500平台测序，测序要求为双端测序80 bp。
   

实验结果

利用KAPA HyperPrep kit对不同浓度低起始量gDNA 和 cell-free DNA进行TAPS文库构建，当DNA起始量为1 ng时，可以成功构建测序文库 (见原文中Supplementary Figure 15)。成库后，可见大部分片段长度在300 bp左右。
       由于cfDNA多为游离DNA，在建库初期有明显的160 bp片段，可能是由于血浆核酸酶的降解，在建库后的胶图中可以看到片段都集中在在300 bp，详见原文中Supplementary Figure 15的右侧图。
       TAPS对于CpG岛 (CGI) 通常有更好的覆盖度,使得WGBS和TAPS之间的存在测序深度差异 (见原文Figure 4a)。同时这些结果也表明TAPS可以取代WGBS，可以提供更全面的甲基化图谱。从 (见原文Figure 4b) 的结果中可以清楚地看到TAPS可以覆盖更多的CpG位点数。同时，在 (见原文Figure 4c) 中可以看到WGBS和TAPS均有较高相关的甲基化跨染色体区域。紧接着，研究者定义了“修改的CpG”为所有CpG位点，且其修饰水平至少为10%，以此为阈值，TAPS中有96.2%的被重新校正后可用读段，表示WGBS和TAPS之间有很好的一致性 (见原文Figure 4d)。比较WGBS和TAPS之间每个CpG覆盖的修改水时，发现两种方法有很好的一致性r = 0.68 (见原文Figure 4e)。这说明TAPS可以很好的取代WGBS，甚至可以得到更全面的甲基化组。
      通过TAPS在全基因组进行小鼠胚胎干细胞5mC和5hmC图谱绘制，与WGBS相比，TAPS有较高的映射率，更均匀的覆盖度和较低的测序成本，可以实现质量更高，信息更全面和价格更优惠的甲基化组分析。

参考文献

1. Liu, Y., Siejka-Zielinska, P., Velikova, G., Bi, Y., Yuan, F., Tomkova, M., Bai, C., Chen, L., Schuster-Bockler, B. and Song, C. X. (2019). Bisulfite-free direct detection of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine at base resolution. Nat Biotechnol 37(4): 424-429.
2. 罗氏诊断产品（上海）有限公司生命科学部. KAPA hyper plus 产品说明书.