实验名称：胃癌类器官与胃癌患者各组织的全外显子组及表达谱相似度
产品名称：KAPA HyperPrep 试剂盒及KAPA Stranded mRNA-Seq 试剂盒

[KAPA建库试剂盒在生物样本库中的应用] 生物样本库是融合生物样本实体、生物分子信息以及样本表型数据的综合资源的一项系统工程，对于开展人类疾病预测、诊断、治疗研究具有不可替代的重要作用。转化医学的兴起和发展对生物样本资源的迫切需求与日俱增，对生物样本库的数量和质量也提出了更高的要求。而二代测序技术的蓬勃发展，为生物样本库的开发提供了更加有力的支持。全基因组、全外显子组、转录组、表观遗传组等测序结果，不仅可以帮助我们得知取得的生物样本的质量，构建的实验模型是否能够真实地反应现实状况，而且还可以进一步地在药物筛选、药物作用机制、疾病亚型及治疗靶点等方面发挥作用。KAPA NGS建库产品即用体系，简单流程，适用批量处理，全面支持多个自动化平台的特点，为通过二代测序技术进一步开发生物样品库的应用提供了保障。

研究背景

胃癌有明显的分子异质性，具有侵袭力强和易抗药的特点。因此，构建良好的体外模型，包括独特的亚型是极为重要的。本研究中建立了一个胃癌类器官生物库，包括34名患者的正常、发育不良、癌症和淋巴结转移组织，并且34名患者中包括大多数已知的分子亚型 (包括EBV、MSI、肠道/CIN和弥漫性/GS，具有CLDN18-ARHGAP6或CTNND1-ARHGAP26融合或RHOA突变)，通过构建胃癌类器官和胃癌患者各组织的外显子和转录组文库，分析得到即使经过长时间培养，类器官仍然能与患者组织在形态、转录组和基因组图谱方面保持不变。大规模药物筛选显示类器官对最近批准或临床试验中的药物敏感，包括那帕布林、阿贝马西利布和ATR抑制剂VE-822。因此，构建的胃癌类器官生物库对胃癌的研究和治疗都具有重大的意义和价值。

生物材料：人胃癌类器官和人胃癌组织

实验目的

分别利用KAPA Hyper Prep试剂盒和KAPA Stranded mRNA-Seq试剂盒构建胃癌类器官和胃癌患者各组织的全外显子文库和转录组文库，分析二者的外显子组和表达谱差异，验证构建的类器官是否能够还原真实的胃癌组织情况。

关键词：胃癌，类器官，全外显子组，表达谱，WES，RNA-seq

实验步骤

一、全外显子组文库构建

1. DNA提取：提取胃癌类器官和患者的正常、发育不良、癌症和淋巴结转移组织的DNA。
2. 全外显子组文库构建：Covaris S2将DNA片段打断后，使用550 ng的DNA起始，使用KAPA Hyper Prep文库构建试剂盒进行建库操作，经过末端修复、加A尾、接头连接，磁珠纯化，文库扩增并再次磁珠纯化筛选后，最终文库中片段大小 250-450 bp。详细实验操作参照KAPA Hyper Prep kit建库说明。
3. 捕获探针富集外显子区域：全外显子组文库构建完成之后，利用xGen Lockdown Probes进行外显子区域的靶向富集文库构建。为了更高的捕获效率和文库质量，推荐使用KAPA Target Enrichment Probes（Roche）进行靶向捕获。
4. 测序：在HiSeq1500 (Illumina)平台上进行测序分析，双向测序101 bp，或者也可以在HiSeq X10 (Illumina)平台上进行测序分析，双向测序150 bp。
5. 将获得测序数据比对到人基因组上, 通过生物信息学分析外显子组差异。

1. RNA提取：提取胃癌类器官和患者的正常、发育不良、癌症和淋巴结转移组织的RNA。
2. RNA文库构建：使用KAPA Stranded mRNA-Seq kit 试剂盒进行RNA文库构建，RNA起始量为4 μg，按照试剂盒标准操作流程建库之后，在C1000 (Bio-rad) 上进行12个循环的PCR扩增。
3. 测序：在HiSeq1500 (Illumina)平台上进行测序分析，双向测序101 bp，或者也可以在HiSeq X10 (Illumina)平台上进行测序分析，双向测序150 bp。
   

实验结果

Exome-seq分析结果
作者通过对全外显子数据的分析，得到46个类器官体细胞突变的结果，包括移码突变、无义突变、错义突变、融合、剪接等等，并通过这些体细胞突变结果，对这46个类器官进行聚类，发现可以很好地将来自不同亚型的类器官分开 (见原文Figure1A)。
      此外通过分析全外显子测序数据，得到了46个类器官染色体拷贝数变异的结果，将这46个类器官进行聚类后，可以将来自不同亚型的类器官很好地分开 (见原文Figure2A)。表明不论体细胞图突变结果，还是染色体拷贝数变异结果，都能够证明构建的胃癌类器官能够反映胃癌不同亚型的情况。
     对全外显子数据进一步分析得到类器官经过长期培养前后的LRR和突变分数，其中LRR (Log R radio) 是用来衡量基因拷贝数变化的数值，突变分数反应体细胞突变情况。通过结果发现，经过长期培养前后，LRR和突变分数有着较高的相似性，证明类器官的外显子组不随培养时间增加而改变 (见原文Figure2E)。为了进一步的证明类器官的外显子组不受长时间培养的影响，通过全外显子数据分析类器官经过长期培养前后的单核苷酸变异 (SNV) 结果，韦恩图分析数据表明绝大部分的单核苷酸变异没有发生改变，进一步证明类器官的外显子组不随培养时间增加而改变 (见原文中Figure2F)。
RNA-seq数据分析结果
       通过分析RNA-seq数据，发现胃癌类器官与其对应的原位癌症组织的差异表达基因，其中表达上调的有2965个基因，表达下调的有41个基因。表达上调的基因富集的通路为免疫过程、生物粘附和细胞外基质途径 (见原文中Figure5B和D)。
       RNA-seq数据显示胃癌类器官与其对应的原位癌症组织存在较多的差异表达基因 (见原文中Figure 5 D)，为了进一步验证两者表达的相似程度，通过combat算法校正批次效应后，发现共41对中，有28对很好地聚在了一起了，而未聚在一起的可能是取样时肿瘤纯度较低导致。
       虽然胃癌类器官其对应的原位癌症组织存在着一些差异，总体上两者的表达谱有着很高的相似性（见原文中Figure 5E）。为了验证类器官表达是否随培养时间增长而改变，对长时间培养前后，类器官表达谱进行相关性分析，发现具有很强的相关性。证明类器官的表达不随培养时间增加而改变。

参考文献

1. Yan, H. H, N,, Siu, H. C., Law, S., Ho, S. L., Yue, S. S. K., Tsui, W. Y., Chan, D., Chan, A. S., Ma, S., Lam, K. O., Bartfeld, S., Man, A., H. Y., Lee, B. C.H., Chan, A. S.Y., Wong, J. W. H., Cheng, P. S. W., Chan, A. K. W., Zhang, J., Shi, J., Fan, X., Kwong, D. L. W., Mak, T. W., Yuen, S. T., Clevers, H. and Leung, S. Y. (2018). A comprehensive human gastric cancer organoid biobank captures tumor subtype heterogeneity and enables therapeutic screening. Cell Stem Cell 23(6): 882-897.
2. 罗氏诊断产品（上海）有限公司生命科学部. KAPA Hyper Prep试剂盒产品说明书.
3. 罗氏诊断产品（上海）有限公司生命科学部. KAPA Stranded mRNA-Seq 试剂盒产品说明书.