实验名称：RNA-seq分析不同碳源下空肠弯曲杆菌代谢调控
产品名称：KAPA stranded RNA-seq Kit及KAPA Library Quantification Kit

[KAPA建库试剂盒在微生物研究中的应用] 微生物在人类生活中无处不在，随着二代测序的发展，高通量，高精确性和信息丰富的特点为从基因水平上研究微生物的功能及鉴定提供了新的思路。基于二代测序的微生物组学克服了传统的纯培养方法的技术限制，可以得到更多微生物的信息，结合宏观生态学则能更好地解释微生物菌群的多样性、功能活性等宏观特征。同时在疾病监测、疫情爆发调查以及病因确定研究中，宏基因组测序能够描述样本中存在的所有DNA或RNA信息，从而能在没有临床线索的情况下发现新的病原体以及耐药相关的突变。KAPA文库制备试剂能够实现简单快速的文库构建，针对宏基因组样本提供均一的扩增与转化，为通过NGS技术进行微生物组学及功能基因组学研究提供了系统解决方案 (Roche Dialog，罗氏诊断在华推广KAPA NGS新一代测序系列产品完善基因检测解决方案)。

研究背景

细菌已经进化出不同的机制来分解营养物中的碳源。它们首先消耗首选的碳源，随后才会利用其他碳源。通过调节机制来适应代谢从而最大限度地生长并与其他生物竞争。空肠弯曲杆菌是一种分解氨基酸和有机酸来促进生长的非糖性革兰氏阴性菌。空肠弯曲杆菌更喜欢以丝氨酸和天门冬氨酸作为碳源，但是却缺少已知在其他生物中参与调控碳源利用的调控因子。因此它在首选碳源存在和不存在的情况下是以何种方式来调整代谢的尚不清楚。在本研究通过KAPA stranded RNA-seq kit建库试剂盒辅助进行的转录组分析展示了空肠弯曲杆菌根据碳源的不同调整自身代谢的机制。研究发现在丝氨酸、乳酸和丙酮酸存在的情况下，可以通过抑制一些关键代谢酶的表达来抑制其他碳源的利用。这些代谢依赖的转录抑制同时可能与细胞内琥珀酸的积累有关。因此，本研究根据转录组等数据分析结果，提出了一种在空肠弯曲杆菌中按需调节代谢抑制机制。

生物材料：细菌_C. jejuni strain 81116 (新鲜样品)

实验目的

使用KAPA stranded RNA-seq Kit构建RNA-seq文库，识别加入不同碳源的生长条件下差异表达的基因，进而分析空肠弯曲杆菌是如何根据不同碳源调整自身代谢的。

关键词：空肠弯曲杆菌，碳源代谢，RNA-seq，二代测序，文库构建

实验步骤

1. 总RNA提取及DNA消化：使用RNA提取试剂盒提取细菌总RNA；并使用RNase-free的DNase处理以去除总RNA中的DNA。
2. rRNA的去除：对提取的细菌RNA利用Ribozero Magnetic Kit进行纯化，去除rRNA后进行RNA建库。
3. RNA建库与扩增：使用KAPA stranded RNA-seq文库构建试剂盒进行RNA建库（货号：#07962142001），详细操作流程参照建库说明书。其中对建库起始量调整至159–400 ng，超声进行片段化6 min，85 °C。使用标准去盐TruSeq LT引物 (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA)，根据RNA起始量，调整引物浓度为：50-100 nM。最终文库扩增PCR循环数为6。
4. 文库定量：测序前使用KAPA Library Quantification Kit进行定量分析（货号：#07960140001），文库终浓度为4 nM。
5. 测序：测序在MiSeq测序仪平台上进行，并由平台配套软件进行序列的生成和读取。
   

实验结果

在本研究中，通过转录组分析以及酶分析展示了空肠弯曲杆菌如何根据碳源调整自身代谢。在丝氨酸、乳酸和丙酮酸存在的情况下，它通过抑制一些关键代谢酶的表达来抑制微生物利用其他碳源。
        其中RNA-seq转录组数据分析发现：添加了丝氨酸，在该细菌的指数生长时期部分代谢基因表达下调，包括TCA循环相关蛋白编码基因 (e.g. gltA, acnB, and mqo) ,以及用于分解 (e.g. ansA, ggt, putA, sdaA, cstA, aspA, aspB and acs) 和转运 (e.g. kgtP, lcpT, dcuC, peb1, cstA, cj0203 and c8j_0613) 特定碳源的蛋白的编码基因 (见原文Fig 2A)。说明当用于生长的底物能更有效地分解代谢以产生足够的代谢前体和能量时，机体能利用较少的酶就能产生较高的生长速率。同时识别了三个上调基因 (c8j_1306 - c8j1310, c8j_1143 – c8j_1146 及 c8j_0024) 。在早期稳定生长期，吸收和代谢非丝氨酸底物所必需的蛋白编码基因 (acs, ggt, putA, cstA, gltA, pebA, acnB, ansA, pebC and aspB ) 表达比指数生长期更高。说明该细菌具有分解碳源优先顺序，当丝氨酸被耗尽，用于代谢其他碳源的基因表达上调。许多代谢基因在指数期末期以及稳定期早期表达更活跃 (见原文Fig 2B-I)。RNA-seq分析结果表明该细菌较高的转录组水平上代谢适应性，识别了应对不同的生长底物时基因的差异调节方式。转录组数据证明了代谢调节发生在转录水平上且取决于可用碳源种类。

参考文献

1. van der Stel, A. X., van de Lest, C. H. A., Huynh, S., Parker, C. T., van Putten, J. P. M. and Wosten, M. (2018). Catabolite repression in Campylobacter jejuni correlates with intracellular succinate levels. Environ Microbiol 20(4): 1374-1388.
2. 罗氏诊断产品（上海）有限公司生命科学部. KAPA stranded RNAseq kit建库试剂盒.