实验名称: 靶向RNA测序诊断融合基因
产品名称: KAPA Stranded mRNA-Seq Kit及KAPA Stranded RNA-Seq Library Preparation Kit

[KAPA NGS产品在肿瘤研究中的应用] 下一代测序技术 (NGS)，又称为大规模平行测序技术，通常指第二代和第三代测序技术，与一代测序技术相比，其在测序速度以及成本上的优势使得该技术在肿瘤研究尤其是肿瘤诊断 (肺癌、结肠癌、乳腺癌、胃癌) 及个体化用药治疗上的应用变为可能。
   构建高质量文库是运用NGS技术进行科学/临床研究的第一步也是非常关键的一步。进行肿瘤研究的文库类型主要有以下5种：全基因组测序 (WGS) (针对DNA)、全外显子组测序 (WES) (针对DNA)、全转录组测序 (针对RNA的RNA-seq)、 表观组测序 (甲基化及ChIP-seq)和靶向靶标测序 (DNA和RNA)。
   在科研及临床研究中，用于肿瘤相关研究的原始样品主要包括：FFPE样品、体液、单细胞、游离核酸等。从样品中分离出的用于文库构建的核酸起始样品量比较低 (通常1 ng 到几百ng 不等)，且核酸分子质量不高 (降解、损伤)。这些都对构建达到测序标准的高质量文库提出了挑战。
   Roche KAPA文库制备试剂为通过NGS进行肿瘤研究提供了整套解决方案 (Roche Dialog，罗氏诊断在华推广KAPA NGS新一代测序系列产品完善基因检测解决方案)。KAPA人类基因组DNA定量及QC试剂盒可以在单次检测中同时评估样本量及样本质量，严防谨守助力深度测序；Roche DNA文库构建试剂盒 (KAPA HyperPrep Kit, KAPA HyperPlus Kit) 及RNA文库构建试剂盒 (KAPA RNA HyperPrep Kit) 等试剂盒具有操作极简 (一管到底)，建库快速 (单日内可完成)，文库质量和得率双高等优点；文库定量试剂盒 KAPA Library Quant Kit质量同监，为测序把好最后一道关；而mRNA-capture Kit、RNA-Seq with RiboErase和纯化磁珠对目标核酸分子的富集可有效降低测序成本。这些试剂盒可有效帮助用户获得稳定可靠的测序结果，为后期的科学实验验证及临床研究提供可信的数据依据。 (测序中国, 案例解析： 定向进化的KAPA酶，从困难样本获得高质量NGS数据的“灵魂”)

研究背景

融合基因是癌症发生的主要原因。其快速准确的诊断能够指导临床行动，但是目前分子诊断方法在分辨率和通量方面都受到抑制。荧光原位杂交 (FISH) 和实时定量聚合酶链反应 (RT-PCR) 尽管敏感度较高，但是只能检测单个融合基因，使得诊断变得冗长、反复且昂贵。此外这些方法不能够识别新的融合基因伴侣或者解析复杂的结构重组。RNAseq能够解决上述一些问题，但是对于低表达的融合基因以及在样本癌细胞浓度低的情况下敏感性很差。文章证明了靶向RNA测序 (RNA-seq) 能够克服这些限制，敏感地检测到罕见或者较低表达的转录本。本研究中，首先通过靶向RNAseq建立了融合基因检测方法；其次，评估其用于融合基因检测的诊断能力和优势。文章预测靶向RNAseq将促进临床融合基因的检测以及对融合基因生物学问题更深入的理解。
生物材料：肿瘤或细胞来源 (新鲜冰冻样品以及FFPE样本)

实验目的

通过Stranded RNA-Seq Library Preparation Kit，Roche-NimbleGen standard double-capture protocol进行靶向捕获富集。利用靶向RNA-seq识别融合基因，探讨靶向 RNA-seq促进临床融合基因检测的潜力。
关键词：靶向RNA-seq (targeted RNA-seq)，融合基因，RNA-seq，临床诊断，NGS

创新应用

靶向建库在Stranded RNA-Seq Library Preparation Kit建库完毕后，加入Roche-NimbleGen standard double-capture进行后期捕获。

实验步骤

1. 血液及细胞样本处理：细胞系及病人血液样本均使用Trizol提取全RNA；而后用DNase去除基因组DNA.
2. 组织样本处理：新鲜组织，病人来源细胞用Trizol提取全RNA, FFPE样本脱蜡后，用AllPrep DNA/RNA FFPE kit试剂盒提取RNA。
3. 文库构建：在KAPA Stranded RNA-Seq建库之前，先利用KAPA mRNA Capture 试剂盒 (货号: 07962231001) 富集成熟的带有poly (A) 尾的RNA，起始量4 μg；接下来利用KAPA Stranded RNA-Seq文库构建试剂盒 (货号: 07962142001)及KAPA Pure Beads(货号: 07983271001)制备高质量RNA文库，起始量100–1000 ng。一些实体瘤样本中加入了1 μl的spike-in对照 (1:50稀释)。建库流程参照说明书，接头使用Roche SeqCap adapters，最终循环数为8-12，根据不同样本而定。
4. 靶向序列捕获：利用KAPA Stranded RNA-Seq文库构建试剂盒建库之后，利用Roche-NimbleGen RNA捕获探针与 Standard Double-Capture Protocol进行靶向捕获富集。
5. 测序：所有文库测序都在HiSeq 2500 v4.0 平台上进行。获得双端125 bp原始数据。

实验结果

FISH 及RT-PCR是诊断基因融合的常规方法，本文中作者开发了一种靶向RNAseq方法，该方法使用生物素化寡核苷酸探针来富集目标RNA转录本。本方法可在一个实验中靶向捕获数百个基因 (方法流程见图1).


图 1. 靶向RNAseq实验流程图 (本图改自Heyer, et al., 2019中的Fig 1a)

        本研究通过对多个细胞系进行检测分析，发现与传统的RNA-seq相比，靶向RNA-seq方法在检测融合基因上更有优势，例如EWSR1-FLI1。同时在两例肺癌患者肿瘤组织中发现，靶向RNA-seq不仅能够确认ROS1和ALK的重组现象，同时能够确定其伴侣基因以及融合连接位点 (图 2)。在72个临床样本队列中，通过靶向RNA-seq的方法将融合基因检测率从63%提高到76%，并且与之前的诊断具有高度一致性。


图 2. 临床样本融合鉴定. a. 临床样本中融合基因鉴定。 b. MO-16-000393肺癌中EZR和ROS1基因附近read覆盖度。虚线为融合连接位点 (fusion junction)。 (本图改自Heyer, et al., 2019中的Fig 3d. e)。

靶向RNA-seq在五个CML患者中确定了与imatinib治疗反应相关的BCR-ABL1异构体 (图3a)。同时识别了10个不同的TMPRSS2-ERG融合异构体，其中多数表现出了TMPRSS2转录起始位点5´末端的多样性 (图3b)。这些研究表明靶向RNA-seq在检测不同融合基因异构体的独特优势，能够为临床指导提供信息。
        靶向RNA-seq能够用于统计基因和外显子的表达。首先根据reads深度的变化来识别融合连接位点 (图3c及3d)。研究表明融合基因发生可能与基因表达相关，例如EZR-ROS1融合基因表达量要高于非重组基因 (图3c)。文章预测靶向RNA-seq将促进临床融合基因的检测，并且不断增加其应用将会提供对融合基因生物学问题更深入的理解。


图 3. 融合接合多样性及基因表达. a. BCR-ABL1融合异构体。b. TMPRSS2和ERG基因结构以及TMPRSS2-ERG融合异构体发生率。c 和 d. EZR-ROS1和ACLS3-ETV1融合示意图及表达。 (图摘自Heyer et al., 2019中的Fig 4)

参考文献

1. Heyer, E. E., Deveson, I. W., Wooi, D., Selinger, C. I., Lyons, R. J., Hayes, V. M., O’Toole, S., Ballinger, M. L., Gill, D., Thomas, D. M., Mercer, T. R. and Blackburn J. (2019). Diagnosis of fusion genes using targeted RNA sequencing. Nat commun 10(1): 1388.
2. 罗氏诊断产品（上海）有限公司生命科学部. KAPA Stranded mRNA-Seq Kits试剂盒说明书.
3. 罗氏诊断产品（上海）有限公司生命科学部. KAPA Stranded RNA-Seq Library Preparation Kit建库试剂盒说明书.