Transcardiac Perfusion of Mouse Brain Dissection and Fixation

材料与试剂

1. 量筒 (蜀牛)
2. 烧杯 (蜀牛)
3. 温度计
4. 生理盐水 (0.9%氯化钠溶液)
5. 1.5%戊巴比妥钠溶液 (溶于生理盐水中)
6. NaH₂PO₄•2H₂O (沪试，catalog number: 20040718)
7. Na₂HPO₄•12H₂O (沪试，catalog number:10020318)
8. 多聚甲醛 (Sigma，catalog number: 158127)
9. NaOH (沪试，catalog number: 10019718)
10. HCl (生工，catalog number: 10011018)
11. 去离子水
12. 4%多聚甲醛溶液 [溶于0.1 M磷酸缓冲液 (PB)，pH 7.0~7.4，见溶液配方]
    

仪器设备

1. 通风橱
2. 解剖镊 (瑞沃德，catalog number: F12018-13)
3. 眼科镊 (瑞沃德，catalog number: F12006-10)
4. 止血钳 (瑞沃德，catalog number: F21002-12)
5. 解剖剪 (瑞沃德，catalog number: S13052-12)
6. 精细剪 (瑞沃德，catalog number: S12005-10)
7. 血管夹 (瑞沃德，catalog number: R33001-48)
8. 称量勺 (Fisher Brand，catalog number: 21-101-10)
9. 1毫升无菌注射器 (洪达，catalog number: zsq08)
10. 4号或5号静脉输液针 (丰临)
11. 20毫升注射器 (洪达，catalog number: zsq08)
12. (可选) 恒流泵 (LONGERPUMP，catalog number: BT100-2J)
13. 带加热装置的磁力搅拌器 (SCILOGEX，catalog number: MS7-H550-Pro)
14. 分析天平 (SARTORIUS，catalog number: BSA124S)
15. 微型台式真空泵 (LONGERPUMP，catalog number: BT100-2J)
16. 50毫升离心管 (THERMO，catalog number: 339652)
17. 0.22微米PVDF瓶顶过滤器 (Thermo Fisher，catalog number: 291-4520)
    

    
    
    图1. 手术器械
    

实验步骤

1. 术前准备
1.1
称量小鼠体重并记录 (精确到克)。根据小鼠体重，按照每10克体重注射0.06毫升的剂量，用1毫升无菌注射器吸取适量1.5%戊巴比妥钠溶液备用。
1.2

拎起小鼠尾部，将小鼠置于笼架上。一手拉住小鼠尾部使其抓紧笼架、身体绷直，另一只手按住小鼠颈部后，尽可能多地捏住小鼠颈部皮肤，固定小鼠身体，保证小鼠在注射过程中不会移动。     





图2. 小鼠抓取与腹腔注射



1.3
将小鼠翻转至腹部朝上，在偏左或偏右的下腹部进针，腹腔注射1.5%戊巴比妥钠溶液。进针不需太深以避免刺入脏器，有明显穿透感但无阻碍感即可 (图2)。
1.4

将小鼠放回笼内，等待约5分钟，挤压小鼠脚趾或尾部，观察其是否失去反应，以确认是否进入深度麻醉状态。

注：对于出生6天以内的新生小鼠，可采用低温麻醉。将新生小鼠放入纸筒、塑料管或包裹在乳胶手套中 (可剪下乳胶手套的拇指部分用于放置小鼠)，用碎冰埋至颈部，保持10~15分钟以达成深度麻醉状态。麻醉状态在常温下仅能保持约10分钟，因此不能将小鼠长时间留在手术台上，应尽快进行手术。

1.5
(从此步骤起，在通风橱中进行操作) 确认小鼠进入麻醉状态后，将其腹部向上摆放在聚苯乙烯泡沫塑料板或软木材质的手术台上，四肢用胶带或针头/大头针固定，使其在灌流过程中无法随意移动。
       注：若麻醉过量导致小鼠心脏停跳，应尽快开始灌流，避免凝血导致灌流不畅。

1.6

剪去中国国家标准4或5号 (对应于国际通用标准的25 G或27 G) 静脉注射针针头尖端的一部分，使其略微变钝 (图3)，以防进针时刺破主动脉壁。





图3. 修剪针头 (A) 未修剪针头 (B) 修剪后针头



1.7
将静脉注射针连接到提前吸满生理盐水的20毫升注射器上。
1.8
取另一20毫升注射器，吸满4%多聚甲醛溶液备用。
2. 主动脉灌流
   2.1

   用眼科镊拉起胸腔外侧皮毛，用解剖剪剪去皮肤，暴露白色剑突。
   2.2

   用眼科镊拉起剑突，用解剖剪沿剑突下方横向剪开肌肉层，暴露横膈膜。
   2.3

   用精细剪小心剪开横膈膜，注意不要伤到上方的心脏。
   2.4

   沿胸骨外侧剪开两侧肋骨，翻开胸廓前壁并用止血钳固定 (或者将此部分组织完全剪除)，以使得心脏完全暴露，可看到颜色较深的右心室 (静脉血) 以及颜色较浅的左心室 (动脉血) (图4)。
   
   
   图4. 开胸后示意图
   
   
   2.5

   用眼科镊及解剖镊清理心脏周围脂肪组织，暴露升主动脉。
   2.6

   用眼科镊固定心脏，从左心室紧靠心尖处，以大致平行于心脏左右中线的角度刺入注射针 (图5A)。由于针尖已经修钝，进针时会有一定的阻力感；成功穿透心室壁时，会有明确的穿透感 (图5B)。切忌用力过猛，或角度过偏，否则有可能穿过左右心室的间隔，进入右心室，或是直接扎穿整个心脏。
   2.7

   继续沿着初始方向进针，若方向准确，将不会感到明显阻力，并在针头进入主动脉时透过主动脉壁，观察到针头 (图5C~D)。即刻用血管夹夹在针头处 (图5C箭头位置)，将其固定于主动脉内。
   注：

   1. 如果不能成功将针头插入主动脉中，也可将其留置于左心室中 (进针约0.5厘米深度)，用止血钳夹持固定 (图5B箭头位置)，或者用大头针或针头插在手术台上辅助固定。成功进针后，随着心脏的搏动可见回血。
   2. 小于一周龄的幼鼠由于心脏很小，主动脉进针难度很大，且不便用血管夹或止血钳固定针尖与心脏，可考虑采用10毫升手持注射器进行心室灌流。

   
   
   
   图5. 进针步骤。(A) 于左心室尖端，以大致平行于心脏左右中线的角度刺入注射针。(B) 进针约0.5厘米后，可将针头留置于左心室中进行灌流。注意进针方向，避免刺穿左右心室之间的隔膜 (空心箭头)。(C~D) 继续进针，即可将针头送入主动脉中 (C，白色箭头)，透过主动脉壁能够观察到针头所在 (D，白色箭头)。利用血管夹固定后，即可进行灌流。(A~C) 为示意图。(D) 为实际进针情况。(E) 灌流前肝脏呈深红色。(F) 生理盐水灌流后失血的肝脏。若一直保持血色或有不均匀的血块，则说明灌流效果不佳。
   
   
   2.8

   用精细剪在右心房上剪开一个小口，将观察到深红色血液流出。
   2.9

   手持针管，匀速推注生理盐水，速度约为每5秒1毫升。当针头留置在心室而非主动脉时，应适当调慢速度。除针筒外，也可使用蠕动泵灌注，以更好地控制速度。若进针位置正确，左右心室间隔无破损，将观察到右心房持续流出血液，肝脏逐渐失血 (图5E~F)。若进针位置不准，致使生理盐水直接进入右心室，可能会观察到肺部膨大，甚至有液体从鼻尖流出。若肝脏不能完全失血，保留不均匀的红色，则说明灌流效果不佳。
   注：若进针角度有误或过深导致扎穿心脏或进入右心室，应及时退针重进，一般不会影响灌流效果。
   2.10

   待观察到流出液体变澄清，肝脏完全失血后，可停止生理盐水灌流。一般成年小鼠生理盐水的灌流量约为15~20毫升。
   
   

   

   视频1. 小鼠心脏灌流。

   
   
3. 4%PFA灌流
   3.1

   将静脉注射针换连到提前吸满4%多聚甲醛的20毫升注射器上，注意不可引入气 泡。
   3.2

   手持针管，匀速推注多聚甲醛，速度约为每5秒1毫升。当4%多聚甲醛流经小鼠身体时，可观察到肌肉收缩、胸腔上拱、尾巴翘起摆动等现象，用手触摸颈部可感到较为僵硬，肝脏颜色略微变黄。一般成年小鼠灌流用量约为15~20毫升。
   3.3

   灌流结束后拔出针头，将小鼠从手术台上取下。整个小鼠身体将呈僵直状。
4. 剥离鼠脑
   4.1

   用解剖剪断颈，剪下小鼠头部 (图6水平虚线，从颈部向鼻尖方向剪开头部上方的皮毛 (图6带箭头虚线)，暴露出颅骨。
   4.2

   用解剖剪切除脑干，用精细剪剪除颅骨周围肌肉，暴露颅骨底部枕骨。
   4.3

   将精细剪单侧刀刃平行于鼠脑底部插入枕骨下方，向外分别剪断两侧颅骨。
   4.4

   用解剖镊小心摘除覆盖小脑的颅骨。
   4.5

   将精细剪的单侧刀刃从颅骨中缝处插入，刀刃一侧朝向颅骨，避免损伤脑组织，沿中缝剪开大脑上方至嗅球上方颅骨。直于鼠脑顶部插入中缝剪开颅骨，用解剖镊小心剥离。

   
   

   
   图6. 剥离鼠脑。(A) 断颈，从颈部朝鼻尖方向 (虚线) 剪开头部上方皮毛，暴露颅骨。(B~C) 沿虚线剪除脑干以下的颅骨，依次移除小脑和大脑部位的颅骨，暴露脑组织。

   4.6

   用称量勺 (或其他平面钝头工具) 从鼠脑底部平行插入到嗅球底部，切断下方神经束，取出鼠脑。
   4.7

   将鼠脑放入4%多聚甲醛溶液，4度后固定过夜。

         注：成功灌流的鼠脑颜色呈浅黄色，组织较硬；若血液灌流不彻底，则可能整体或局部呈现血红色，组织较软。后固定后鼠脑体积缩小，颜色加深 (图7)。
   
   

   
   图7. 不同灌流状态鼠脑外观。(A) 未灌流鼠脑,外观呈红色，可见明显红色血管分布; (B) 灌流失败鼠脑，整体外观呈现粉红色; (C) 灌流成功且未进行后固定鼠脑，整体颜色较白; (D) 后固定后鼠脑体积略微缩小，颜色略微加深。

   4.8

   将后固定结束的鼠脑转入含有0.01%叠氮钠的磷酸缓冲盐溶液 (PBS) 中，4度保存；或转入30%蔗糖溶液，待沉底后负20~80度冰冻保存。

失败经验

      表1.  常见问题分析及解决方案

溶液配方

1. 4%多聚甲醛的配制 (以4 L为例，配制其他体积可参见表2)
1. 用去离子水清洗量筒、烧杯等；
2. 使用一次性称量船，分别用分析天平称取12.481克二水合磷酸二氢钠与114.605克十二水合磷酸氢二钠，溶于2升去离子水中；
3. 将溶液放置于微波炉中最高火加热，每隔3~5分钟取出测量温度，直至溶液温度到达60度；
4. 用分析天平称取多聚甲醛干粉160克，倒入烧杯底部，避免粉末飞溅；
   注：需穿戴好口罩等防护用品，避免吸入粉末。
5.  在通风橱内将预热后的磷酸缓冲液倒入盛有多聚甲醛的烧杯；
6. 将烧杯置于磁力搅拌器上，加入磁力搅拌子，开启磁力搅拌器；打开加热板，设置恰当的加热档，保持烧杯内溶液温度在50~60度之间。待多聚甲醛充分溶解后，加去离子水定容至4升。
   注：可加入1毫升 5摩尔/升氢氧化钠溶液助溶，待多聚甲醛溶解完全后，加入等摩尔量的盐酸中和。若使用12摩尔/升盐酸，则需加入0.4毫升。
   配置5摩尔/升氢氧化钠溶液：在50毫升离心管中称量约2克氢氧化钠，加入10毫升去离子水，轻柔摇晃溶解。氢氧化钠溶解时大量产热，故切勿盖盖或或剧烈摇晃，以防离心管爆炸或溶液飞溅；
7. 将0.22微米PVDF瓶顶过滤器与微型台式真空泵相连，过滤多聚甲醛溶液；
8. 过滤后的溶液分装入50毫升离心管，-20度冻存；
   注：每管体积不超过45毫升，以防冰冻后体积增大，溶液溢出。
9. 冻存后的多聚甲醛溶液使用前可放置4度或室温融化，并充分颠倒混匀。
   
       表2. 配制不同体积4%多聚甲醛的药品配比

   注：由于甲醛干粉易飞，溶液挥发也会刺激眼睛和呼吸道粘膜，称量和分装需佩戴口罩、护目镜等护具。

伦理学声明

本实验对小鼠进行的所有研究行为均遵循和符合国家《实验动物管理条例》和有关动物保护与使用的法律和法规，并获得复旦大学实验动物中心动物伦理委员会批准。

参考文献

1. Gage, G. J., Kipke, D. R. and Shain, W. (2012). Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp(65).
2. https://www.mcgill.ca/research/files/research/305-_transcardiac_perfusion_-_jan_2018_1.pdf
3. https://www.mbl.edu/bie/files/2015/01/mouse_transcard_perf11.pdf