DNA Content Analysis in Marine Microorganisms by Flow Cytometry

材料与试剂

1. 70 μm细胞过滤器 (Beyogold, catalog number: FSTR040)
2. 流式管 (BD Falcon, catalog number: BD 352054)
3. 蛋白酶K (Solarbio, catalog number: P9460)
4. 碘化丙啶 (Signalway Antibody LLC, SAB, catalog number: CA001)
5. PBS (pH = 7.2~7.4, Solarbio, catalog number: P1020)
6. 柠檬酸钠 (上海国药，catalog number: 241245)
7. Triton X-100 (Solarbio, catalog number: T8200-100ml)
8. 50% 的戊二醛溶液 (Sangon Biotech, catalog number: A500484)
9. PI (Solarbio, catalog number: P8080)
10. PI溶液 (见溶液配方)
11. 1% 柠檬酸钠 (见溶液配方)
12. 0.1% Triton X-100的PI溶液 (见溶液配方)

仪器设备

1. 流式细胞仪 (美国BD公司，model: FACSAriaIII)
2. 低速离心机 (中科中佳科学仪器公司，model: LX-200)
3. 小型低温高速离心机 (德国Eppendorf公司，model: 5424R)
4. -80 °C冰箱 (中国海尔集团，model: DW-86L388)
5. 移液器 (德国Eppendorf公司)
   

实验步骤

1. 在福建附近海域，依据采水标准层次采取50~200 ml水样。采水器上的采样瓶、采样袋及实验室内样品处理过程均需无菌操作 (Gregori等，2001)。
2. 样品预处理：水样经70 μm滤膜进行预过滤，去除杂质，以免堵塞流式细胞仪。水样中加入浓度为50% 的戊二醛，使其终浓度达到0.5%，蛋白酶 K，使其终浓度达到20 g/L，轻轻混匀，避光固定15~20 min (杨等，2017)。如果样本不能在采集12小时内完成检测，可用移液器转移已固定好的水样于冻存管内4 °C保存，一个月内完成流式检测。若需长期保存，需将固定好的水样放于液氮中快速冷冻，最后放置于-80 °C冰箱中保存直至分析。
3. 样品准备：若为-80 °C冰箱保存的水样，需将其放入4 °C冰箱解冻。
4. 将已准备好的水样于12,000 x g 室温离心10 min，小心去除上清，收集沉淀 (沉淀即为水样中的微生物)，若无明显沉淀可留取离心管底部液体用于后续实验 (Alapat，2018)。
5. 用2 ml PBS将微生物沉淀重悬，清洗，12,000 x g 室温离心5 min，小心去除上清，收集微生物沉淀，此步骤重复2~3次。若无明显沉淀，只需用PBS清洗1次。
6. 用200 μl PBS重悬步骤5中的微生物沉淀，加入1 μl PI 染料，混匀，室温避光染色10 min (Wu 等，2018; Zhang 等，2018)。
7. 加入2 ml PBS重悬，12,000 x g 室温离心10 min，小心吸弃上清，收集微生物沉淀。
8. 重复步骤7，将多余的PI染料去除，预留200 μl溶液上机检测。
9. 在流式细胞仪上，先用未染色的微生物悬液设置检测参数，调节检测电压和阴性区域。
10. 上机检测至少获取1 × 10⁵ 的阳性细胞做后续数据分析。
    

结果与分析

Correia等研究发现过氧化氢可以明显阻滞白色念球菌的细胞周期，其DNA含量呈现差异表达。如图1所示，横坐标表示DNA含量，通过PI的荧光强度显示，荧光越强，DNA含量越高；纵坐标表示细胞的数目。不同的峰代表处于不同的细胞周期，DNA含量处于2n~4n。红色代表正常培养状态下每隔15 min检测的白色念球菌DNA含量，灰色代表经1 mM H₂O₂处理不同时间检测白色念球菌DNA含量 (Correia等，2016)。若没有看到明显的特征峰，则表示实验失败，可能由于细胞破膜不充分，PI没有和细胞内DNA充分结合而导致实验失败。


图1. 过氧化氢阻滞白色念珠菌细胞周期于G1期. 白色念球菌在正常的培养条件和含1 mM H₂O₂的培养液中培养，每隔15 min收集菌液，经0.5% 戊二醛固定，PI染色，流式检测其DAN含量。红色代表白色念球菌在正常培养条件下DNA含量，灰色代表经H₂O₂处理后白色念球菌DNA含量 (Correia等，2016)。

溶液配方

1. PI溶液
   用1 ml含有1% 柠檬酸钠的无菌水将10 mg PI粉末溶解，配置成浓度为10 mg/ml的储存液，-20 °C冰箱避光保存。使用时将储存液稀释200倍 (终浓度为50 μg/ml)，加入Triton X-100，使其终浓度达到0.1%
2. 1% 柠檬酸钠
   称取0.1 g柠檬酸钠溶于1 ml无菌水中
3. 0.1% Triton X-100的PI溶液
   用移液器缓慢的吸取10 μl Triton X-100加入

致谢

本工作的顺利开展得益于国家自然科学基金项目 (资助号：81703555，81773063，U1505225和81273548)、国家重点基础研究发展计划 (973计划) 项目 (资助号：2015CB931804)、中国大洋专项课题 (资助号：DY135-2-13)、福建省科技厅平台项目 (资助号：2018N2001)、教育厅平台项目和中国博士后科学基金 (资助号：2017M620268)的经费支持。

参考文献

1. 杨莉婷，何丽，何海宁，吴琼. (2017). 流式细胞术对生乳中微生物检测的应用研究. 广西师范大学学报, 2: 112-116.
2. Alapat, D. (2018). Cytoplasmic immunoglobulin vs. DNA analysis by flow cytometry. Methods Mol Biol 1792: 35-45.
3. Correia, I., Alonso-Monge, R. and Pla, J. (2016). The Hog1 map kinase promotes the recovery from cell cycle arrest induced by hydrogen peroxide in Candida albicans. Front Microbiol 7: 2133.
4. Gregori, G., Citterio, S., Ghiani, A., Labra, M., Sgorbati, S., Brown, S. and Denis, M. (2001). Resolution of viable and membrane-compromised bacteria in freshwater and marine waters based on analytical flow cytometry and nucleic acid double staining. Appl Environ Microbiol 67(10): 4662-4670.
5. Naganowska, B., Wolko, B., Sliwinska, E. and Kaczmarek, Z. (2003). Nuclear DNA content variation and species relationships in the genus Lupinus (Fabaceae). Ann Bot 92(3): 349-355.
6. Wu, D., Liang, M., Dang, H., Fang, F., Xu, F. and Liu, C. (2018). Hydrogen protects against hyperoxia-induced apoptosis in type II alveolar epithelial cells via activation of PI3K/Akt/Foxo3a signaling pathway. Biochem Biophys Res Commun 495(2): 1620-1627. 
7. Zhang, N., Fan, Y., Li, C., Wang, Q., Leksawasdi, N., Li, F. and Wang, S. (2018). Cell permeability and nuclear DNA staining by propidium iodide in basidiomycetous yeasts. Appl Microbiol Biotechnol 102(9): 4183-4191.