Antibody Titration by Flow Cytometry

材料与试剂

1. 5 ml 流式管
2. 可放置5 ml流式管的试管架2~3个
3. 解剖工具和烧杯
4. 六孔板
5. 枪尖若干：2 µl、20 µl、100 µl、200 µl 和 1 ml 
6. 40 μm过滤筛
7. 15 ml离心管
8. 1 ml带针注射器
9. 96孔U型底板
10. 小鼠 (C57BL/6小鼠，雌雄不限，8周以上，1只)
11. 待滴定的流式抗体 (本文以Anti-Hμman/Mouse CD45R (B220) Alexa Fluor 700为例，eBioscience，catalog number: 56-0452-82)
12. 2% 新生牛血清
13. DNase I (Worthington，catalog number: LS002140)
14. FCS
15. PBS 溶液和蒸馏水 (0.22 µm 滤膜过滤)
16. RPMI-1640 (HyClone, catalog number: SH30809.01)
17. 25 mM HEPES pH7.4 (Sigma-Aldrich，catalog number: H3375)
18. EDTA
19. NaN₃
20. R2培养基 (见溶液配方)
21. 组织分离培养基 (见溶液配方)
22. FACS缓冲液 (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 10 µl、200 µl、1,000 µl移液枪
2. 台式冷冻离心机 (Thermo，产品型号LEGEND RT+)
3. 细胞颗粒计数仪 (Beckman, 产品型号Coulter Z2)
4. BD FACS 流式细胞仪 (BD，产品型号BD LSRFortessa)，配置 3B-6V-4YG-3R-2UV (表 1)
   
   表1. 流式细胞仪激光器配置信息
   
   

实验步骤

一、细胞分离

1. 用二氧化碳对小鼠实施安乐死，随后颈部脱位处死。
2. 解剖脾脏 (具体操作步骤详见视频1)，将脾脏放入一个位于6孔板中的40 μm细胞筛中，每个孔内已加入5 ml组织分离液。
   
   
   
   视频1. 解剖脾脏步骤
   
   
3. 用1 ml注射器从孔中吸取1 ml组织分离液，注入脾脏，冲洗脾细胞，然后用干净的注射器柱塞将脾细胞挤压至粉碎，使细胞通过40 μm细胞筛。尽量只施加推力，不要研磨组织。
4. 用1 ml移液枪将脾细胞吹打至无可见团块。
5. 将细胞转移到15 ml离心管中，并在4 °C下311 x g离心细胞5分钟。
6. 倒出上清液，将细胞轻轻地重新悬浮在5 ml FACS缓冲液中；
7. 计数细胞。
   注：请根据实验室具体设备情况，选择相应计数方法。
8. 根据细胞计数结果，取1 x 10⁶细胞在96孔U型板中。
   

表2. 流式染色配置方案

1. 按照以上染色方案预先配制好不同稀释比例抗体单染管溶液50 μl，每孔加入50 μl单染管溶液，离心96孔板 (311 x g，1分钟，4 °C)，除去上清液，轻轻拍打板两侧使细胞颗粒松动；
2. 将Un-stain管细胞重新悬浮在50 μl/孔FACS缓冲液中；其余单染管加入预先稀释好的抗体的单染管，4 °C避光染色30分钟；
3. 在每个孔中加入200 μl的FACS缓冲液，以清洗细胞；
4. 离心96孔板 (311 x g，1分钟，4 °C)，除去上清液，轻轻拍打板两侧使细胞颗粒松动；
5. 再次重复清洗步骤；
6. 向细胞中加入200 μl的FACS缓冲液，并将所有细胞转移到冰上的流式上机管中。

1. 依次创建 New Folder> Experiment > Specimen > Tube。
2. 在Parameters 窗口中保留：Alexa Fluor 700。
3. 上阴性对照管，调节 FSC/SSC 电压，使P1门圈中样本群。
4. 将各单染管依次上样，调整电压，确认阳性群低于各荧光通道的最高检测范围。
5. 依次记录各单染管。

结果与分析

实验结果见图1。


图1. 不同稀释比例的B220-AF700对野生型小鼠脾脏细胞的染色情况

失败经验

1. 使细胞和所用到的缓冲液和试剂尽可能地保持在冰上。
2. 细胞离心后，请用力拍打96孔板以致细胞颗粒松散。
3. 96孔U型板需要移液时尽量用排枪，以免加错孔。
4. 操作过程动作轻柔，尽量避光，于冰上操作；排枪加样、混匀时应小心细致，防止样品污染。
   

溶液配方

1. R2培养基
   RPMI-1640
   2%新生牛血清
   25 mM HEPES pH7.4 
2. 组织分离培养基
   在R2培养基 (100 μg/ml最终) 中添加DNase I
   100 μg/ml (来自10 mg/ml原液)
3. FACS缓冲液
   2% FCS
   2 mM EDTA
   0.1% NaN₃
   溶于PBS (预冷)
   

致谢

侯百东实验室的工作得到中国科学院，国家自然科学基金和国家科技重大专项的支持。