NK Cell Mediated Splenocyte Rejection Assay

研究背景：固有免疫系统主要成员NK细胞能够杀死多种病毒感染细胞，肿瘤细胞，以及参与异基因骨髓移植排斥反应而在免疫防御的过程中扮演着重要角色。NK细胞表面表达大量的活化性和抑制性受体，NK细胞的功能状态取决于这两种受体信号的平衡。目前的研究显示NK细胞以“丢失自我”和“诱导自我”两种模式识别异己，这两种识别方式使得NK细胞打破了活化和抑制信号的平衡进而清除异源细胞。“丢失自我”的识别模式认为正常细胞表面广泛表达MHC-I类分子，它们能够被NK细胞表面的MHC-I类分子依赖的抑制性受体所识别，这种识别介导了强的抑制信号的传递。NK细胞接受的由自身MHC-I类分子识别所传递的抑制信号强于NK细胞表面活化性受体识别所传递的活化信号，因此NK细胞不杀伤正常细胞。当靶细胞上的MHC-I类分子不匹配、表达下降或者丢失时，NK细胞上由MHC-I类分子介导的抑制信号被移除，NK细胞表面活化性受体介导的活化信号占主导地位，NK细胞活化进而杀伤靶细胞。

材料与试剂

1. 镊子
2. 剪刀
3. 60 mm x 15 mm平皿 (Corning, catalog number: 430166)
4. 15 ml离心管 (BD Falcon, catalog number: 352096)
5. 100目滤网
6. 1 ml注射器
7. 注射器活塞
8. 待检测小鼠，一般每组3~5只
9. B6野生型小鼠
10. β2m缺失小鼠
11. 胎牛血清
12. Poly I:C (InvivoGen, catalog number: 31852-29-6)
13. 红细胞裂解液 (eBioscience，catalog number: 00-4333-57)
14. PBS 
15. 1640培养基 (WISENT, catalog number: 350-006-CL)
16. CFSE (eBioscience, catalog number: 65-0850-84)
17. 10 μM CFSE (见溶液配方)
18. 1 μM CFSE (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 细胞计数仪
2. 多色流式细胞仪
3. 超净工作台
4. 水浴锅
5. 离心机
   

实验步骤

1. 小鼠腹腔注射200 μl 1 μg/μl的polyI:C, 18~24小时后用于后续实验。
2. 断颈处死小鼠，在超净台从小鼠腹腔取β2m KO和WT小鼠脾脏，放于含100目筛网和3 ml PBS的60 mm x 15 mm平皿中用注射器活塞研磨至无组织块，收集细胞至15 ml离心管。
3. 400 x g 离心5 min。
4. 弃上清，加1 ml 1x 红细胞裂解液，混匀，冰上裂解5 min。
5. 裂解完成后可见液体红色变淡，加5 ml PBS终止反应，400 x g离心 5 min。
6. 用800 μl PBS重悬β2m KO和WT细胞沉淀，取400 μl重悬的细胞进行实验。
7. CFSE母液浓度为5 mM，配制成1 μM和10 μM工作浓度，避光操作 (见溶液配方)。
8. 混匀后，37 °C水浴锅8分钟，每2分钟混匀一次，避光操作。
9. 迅速加入800 μl FBS，终止反应。
10. 加8 ml PBS，400 x g 离心5 min，洗2次。
11. 使用流式细胞仪检测CFSE标记情况，并保存注射前流式图。
12. 两种细胞1:1混合，尾静脉注射400 μl (每种鼠2 x 10⁶个细胞) 至提前注射了polyI:C的受体鼠。
13. 6小时后，使用流式细胞仪检测小鼠脾脏和淋巴结中CFSE阳性的细胞数，如图1所示收取1 x 10³的CFSE^low的细胞，计算出CFSE^high的细胞的清除效率。清除效率：100 × [1− (收取的CFSE^high细胞数目 × 注射时CFSE^low的细胞比例)/(收取的CFSE^low细胞数目 × 注射时CFSE^high的细胞比例)。
    

结果与分析

分析结果见图1。


图1. WT和KO鼠脾细胞清除效率检测. A. 流式检测WT和KO鼠脾细胞清除；B. 统计分析WT和KO鼠脾细胞清除效率。

溶液配方

1. 10 μM CFSE
   500 μl PBS + 2 μl CFSE (母液5 mM)，此时浓度为20 μM
   混匀，取400 μl与400 μl PBS (β2m KO) 细胞液混匀 
2. 1 μM CFSE
   100 μl 20 μM CFSE + 900 μl PBS，此时浓度为2 μM
   混匀，取400 μl与400 μl PBS (WT) 细胞液混合
   

致谢

董忠军实验室的工作得到清华大学免疫所的支持。本文实验方案改编自本实验室发表的文章 (Chen等，2016)。

参考文献

1. Chen, S., Yang, M., Du, J., Li, D., Li, Z., Cai, C., Ma, Y., Zhang, L., Tian, Z. and Dong, Z. (2016). The self-specific activation receptor SLAM family is critical for NK cell education. Immunity 45(2): 292-304.