Cytokine Secretion Analysis of Mouse Intestinal Innate lymphoid Cells (ILCs) by Flow Cytometry

材料与试剂

材料：

1. 15 ml离心管 (Corning, catalog number: 430791)
2. 5 ml离心管 (Axygen, catalog number: SCT-5ML-S)
3. 50 ml离心管 (Corning, catalog number: 430829)
4. 6孔板 (Corning, catalog number: 3516)
5. 10 cm培养皿 (上海雷布斯，catalog number: 350003)
6. 眼用手术剪 (苏州市施强医疗器械有限公司，catalog number: JYY1030)
7. 眼用镊 (苏州市施强医疗器械有限公司，catalog number: JYN1030)
8. 70 μm滤膜 (Corning, catalog number: 352350)
9. 0.22 μm过滤器
10. 1.5 ml离心管 (Axygen, catalog number: MCT-150-C)
11. 10 ml移液管 (Corning, catalog number: 4488)
12. 3 ml圆头吸管 (Biologix，30-0138A1)
13. 48孔板 (Corning, catalog number: 351178)
14. BD Falcon流式管 (Corning, catalog number: 352052)
    
    

1. Dnase I (Sigma-Aidrich，DN25-1G，配成150 mg/ml的母液，-80 °C保存)
2. Type VIII Collagenase (Sigma-Aidrich，C2139-1G，配成100 KU/ml的母液-80 °C保存)
3. Lonsera乌拉圭 (南美) 特级胎牛血清 (Lonsera, catalog number: S711-001S)
4. 20x PBS缓冲液 (生工，catalog number: B548117)
5. 无水酒精 (常熟市鸿盛精细化工有限公司，catalog number: 64-17-5)
6. 0.5 mol/L EDTA (生工，catalog number: B300599)
7. 二硫苏糖醇DTT (Sigma-Aidrich, catalog number: D9779-1G)
8. RPMI 1640培养基 (HyClone, catalog number: SH30809.01)
9. Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) 双抗 (P/S, Gibco, catalog number: 15140-122) 
10. Percoll (GE Healthcare, catalog number: 17-0891-09)
11. eBioscience^TM Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set (eBioscience^TM, catalog number: 00-5523-00)
12. Trypan Blue 0.4% solution in 0.85% NaCl (Lonza, catalog number: 17-942E)
13. PMA (Sigma-Aldrich，catalog number: P1585-1MG，配成1 mg/ml母液，-80 °C保存)
14. Ionomycin calciumsalt (ENZO，ALX-450-007-M001，配成1 mg/ml母液，-80 °C保存)
15. Brefeldin A Solution (1,000x) (BFA, Biolegend, catalog number: 42060) 
16. 丙三醇
17. 离子霉素
18. DMSO
19. Permeabilization Buffer
20. Fixation/Permeabilization Concentrate
21. Fixation/Permeabilization Diluent
22. 1x PBS (见溶液配方)
23. 75%酒精 (见溶液配方)
24. 洗液1 (见溶液配方)
25. 洗液2 (见溶液配方)
26. 消化液 (见溶液配方)
27. 1640完全培养基 (见溶液配方)
28. DNase I母液 (见溶液配方)
29. Collagenase VIII胶原酶母液 (见溶液配方)
30. 40% Percoll (见溶液配方)
31. 80% Percoll (见溶液配方)
32. PMA和离子霉素刺激剂 (见溶液配方)
33. 细胞活力染料溶液 (见溶液配方) 
34. FACS buffer (见溶液配方)
35. PMA母液 (见溶液配方)
36. 离子霉素母液 (见溶液配方)
37. CD16/32 block染料抗体 (见溶液配方)
38. 抗体混合物溶液 (见溶液配方)
39. Foxp3 Fixation/Permeabilization working solution (见溶液配方)
40. 1x Permeabilization Buffer (见溶液配方)
    
    

1. Fixable Viability Stain 520 (FITC) (BD Biosciences, catalog number: 564407)
2. TruStainfcX^TM (anti-mouse CD16/32) (Biolegend, catalog number: 101320)
3. Hamster anti-Mouse CD3-PE-CF594 (BD Biosciences, catalog number: 562286)
4. Rat anti-mouse B220-PE-CF594 (BD Biosciences, catalog number: 562290)
5. Rat anti-mouseGr1-PE-CF594 (BD Biosciences, catalog number: 562710)
6. Rat anti-mouseCD11b-PE-CF594 (BD Biosciences, catalog number: 562287)
7. Hamster anti-mouseCD11c-PE-CF594 (BD Biosciences, catalog number: 562454)
8. CD45.2-BB660 (BD Biosciences, custom)
9. CD127-PE-Cy7 (BD Biosciences, catalog number: 560733)
10. T-bet-BV711 (BD Biosciences, catalog number: 563320)
11. GATA3-BUV395 (BD Biosciences, catalog number: 565448)
12. RORγt-BV786 (BD Biosciences, catalog number: 564723)
13. IL-5-APC (BD Biosciences, catalog number: 554396)
14. IL-17A-AF700 (BD Biosciences, catalog number: 560820)
15. IFNγ-APC-Cy7 (BD Biosciences, catalog number: 561479)
16. IL-22-PE (Biolegend, catalog number: 516404)

仪器设备

1. 水平摇床 (其林贝尔，model: TS-100)
2. CO₂细胞培养箱 (Thermo Scientific^TM Heracell^TM 150i)
3. 实验室2级生物安全柜 (Thermo Scientific^TM 1300 Series A2 Biological Safety Cabinet Packages)
4. 高速离心机 (Thermo Scientific^TM Sorvall^TM ST 40 离心机)
5. 倒置相差显微镜 (Olympus, model: CKX41)
6. 血细胞计数板 (Sigma-Aldrich,model: BR717805-1EA)
7. X30流式细胞分析仪 (BD FACSymphony^TM系统)
8. 电动移液器 (Eppendorf, model: 4430000018)
   

实验步骤

一.肠道固有淋巴样细胞的制备

1. 将颈椎脱臼处死后的小鼠固定在手术台上，用75%酒精润湿并消毒小鼠腹部。剪开小鼠腹部皮肤后暴露腹腔。
2. 在小鼠胃与十二指肠连接处剪断，一边分离小肠周围脂肪组织和肠系膜，一边拉出小肠，之后在小肠和盲肠连接处剪断，从而分离出小肠，并将小肠放入装有10 ml1x PBS (配制方法见溶液配方，后文中若无特殊说明PBS均指代1x PBS) 15 ml离心管中，置于冰上等待后续操作。从盲肠末端开始至肛门部分的结直肠用同样的方法分离出来，放入装有10 ml PBS的15 ml离心管中，置于冰上。
3. 取出步骤2中的小肠，连同PBS一起倒入10 cm培养皿中，用手托起小肠一端，用眼科剪剪去小肠表面的派氏结 (Peyer’s Patches，PPs) 并用眼科镊小心去除表面所有的脂肪和肠系膜残余组织，再用剪刀纵向剪开小肠 (不必沿着肠系膜方向)，暴露出肠内容物，并在培养皿中涮洗干净。将小肠转移到已装有8 ml PBS的15 ml离心管中，并在转移过程中将小肠分成2 cm左右的小段，置于冰上。用相同的方法分离出干净的大肠 (图1)。
   
     
   图1. 去除小鼠小肠派氏结操作流程. A.去除表面脂肪和肠系膜等组织的小肠，红色箭头指示派氏结；B.剪去派氏结的操作示意图；C.去除派氏结后的小肠，红框是所有剪下来的派氏结。
   
   
4. 将所有装有肠道组织的离心管剧烈手动振荡2 min (视频1)。
   
   
   
   视频1. 手动震荡组织的方法
   
   
5. 现配现用含1 mM DTT的PBS洗液1 (见溶液配方)，含30 mM EDTA的PBS洗液2 (见溶液配方)。
6. 使用镊子直接将步骤4中的肠道组织取出并分别转移到装有10 ml洗液1的50 ml离心管中，220 rpm、37 °C水平摇床剧烈摇晃10 min。
   注：离心管垂直放置。
7. 取出离心管剧烈手动振荡2 min后，将肠道组织分别转到含有10 ml PBS的15 ml离心管中，再次手动振荡2 min。
8. 用镊子取出PBS清洗过的肠组织再分别转到装有10 ml洗液2的50 ml离心管中，220 rpm、37 °C水平摇床剧烈摇晃10 min。
   注：离心管垂直放置。
9. 取出离心管剧烈手动振荡2 min后，重复步骤8。
10. 从水平摇床中取出离心管，手动剧烈振荡2 min后用镊子将肠组织取出并将肠组织转移到含有5 ml 1640完全培养基 (见溶液配方) 的7 ml离心管中，上下颠倒半分钟以清洗残留的洗液2。
11. 根据处理的组织数量现用现配消化液：消化一根小肠需要5 ml含有150 μg/ml DNase I及100 U/ml collagenaseVIII的1640完全培养基。消化一根大肠需要5 ml含有150 μg/ml DNase I和200 U/ml collagenase VIII的1640完全培养基。
12. 用镊子取出步骤10中清洗过的肠道组织，置于装有消化液的六孔板中 (每孔加5 ml消化液)，再分别剪成0.5 cm左右的小段，置于装有消化液的六孔板中，在37 °C，5% CO₂浓度的CO₂培养箱中静置消化90 min。
13. 消化结束后，将每孔培养基和肠道组织转移到干净的15 ml离心管中，剧烈振荡3-5 min，待组织摇碎后，消化液及摇碎的组织经70 μm滤膜过滤，此外还可以用5~8 ml PBS清洗装过培养基的离心管并过滤收集，可以和前面经过过滤的组织液混合 (图2)。
    
    
    图2. 肠道组织经消化振荡后得到的细胞悬液示意图
    
    
14. 收集含有细胞的滤液，400 x g室温离心5 min得到细胞沉淀。
15. 现用现配40% percoll和80% percoll用于密度梯度离心。用4 ml 40%percoll重悬细胞沉淀并转移到15 ml离心管，用3 ml吸管吸取2.5 ml 80% percoll后深入15 ml离心管底部，缓慢加入percoll，形成密度梯度。800 x g室温离心20 min，升速 (ACC) 1，降速 (DEC) 0。
16. 离心结束后，吸取中间层淋巴细胞至10 ml PBS中，上下颠倒混匀，并用800 x g的速度室温离心10 min，去除上清后得到细胞沉淀 (图3，视频2)。
    
    
    图3. 密度梯度离心后得到的产物示意图
    
    
    
    视频2. 吸取密度梯度离心后中间层细胞的过程
    
    
17. 用5 ml PBS重悬细胞沉淀，400 x g、5 min室温离心后去除上清，得到肠道固有层淋巴细胞，活细胞计数后，可用于后续实验操作。
    
    
    

1. 取2 x 10⁶个肠道固有层淋巴细胞，用300 μl 1640完全培养基重悬后转移到48孔板中。
2. 给48孔板的样品细胞悬液中每孔加入3 μl PMA和离子霉素刺激剂 (见溶液配方)，相当于再次100倍稀释。吹打混匀后将48孔板放入CO₂培养箱，37 °C孵育2小时。
3. 2小时后取出培养板，在每孔细胞悬液中加入0.3 μl BFA高尔基体阻断剂 (母液为1,000x)。也可以选择更精确的稀释方法，先用1640完全培养基进行10倍稀释，再加入细胞悬液进行100倍稀释。吹打混匀后将培养板放入CO₂培养箱，37 °C再孵育2小时。
4. 用1.5 ml EP管收集细胞悬液，300 μl PBS清洗培养板后加入对应EP管。500 x g、5 min、4 °C离心，去上清后得到细胞沉淀，可用于后续操作。
   
   

1. 配制细胞流式染色抗体混合物：细胞活力染料抗体、CD16/32 block染料抗体、表面流式抗体混合物。按照100 μl的反应体系进行配制。细胞活力染料Fixable Viability Stain 520 (FITC) 用PBS配制，1:1000稀释。CD16/32 block染料抗体和表面流式抗体混合物用FACS buffer (见溶液配方) 配制，其中先用50 μl的体系1:100配制block溶液，即每个反应50 μl，每50 μl加入0.5 μl CD16/32 antibody。再用50 μl的体积配制表面抗体混合物，补齐100 μl的总反应体系，按照抗体使用说明，每种表面抗体按照1:200的比例稀释。吹打混匀。
2. 用100 μl细胞活力染料抗体重悬上述细胞沉淀，4 °C避光孵育30 min。
3. 加入500 μl FACS buffer清洗细胞，500 x g、5 min、4 °C离心去上清。
4. 每个细胞沉淀中加入50 μl block溶液，重悬细胞后4 °C避光孵育10 min。
5. 直接加入50 μl表面抗体混合物，吹打混匀后4 °C避光孵育30 min。
6. 反应结束后，重复步骤3。
7. 现用现配Foxp3 Fixation/Permeabilization working solution (见溶液配方)，每个反应加入100 μl working solution，充分重悬细胞后，避光4 °C孵育1 h (固定破膜时间最多不超过18 h)。
8. 用双蒸水现用现配1x Permeabilization Buffer (见溶液配方)，并用此溶液配制胞内流式染色抗体混合物 (包括转录因子和相关细胞因子抗体)。反应体系为100 μl，抗体按照1:200稀释，充分混匀后待用。
9. 给步骤7中固定破核的细胞悬液加入500 μl 1x permeabilization buffer，500 x g、4 °C离心5 min，去除上清后得到细胞沉淀。
10. 用100 μl的抗体混合物重悬细胞，充分混匀后置于4 °C避光孵育40 min。
11. 反应结束后重复步骤3。
12. 最后用200~300 μl FACS buffer重悬细胞，再使用70 μm滤膜过滤到流式管中，在流式细胞仪上检测相关细胞因子的分泌情况。

结果与分析

图4. 大肠固有淋巴样细胞分泌细胞因子的能力检测. 所有细胞来自于大肠lineage (CD3，B220，CD11b，CD11c，Gr-1)^-CD45.2⁺CD127⁺活的淋巴细胞群。其中ILC1为lineage^-CD45.2⁺CD127⁺T-bet⁺，主要分泌细胞因子IFNγ；ILC2为lineage^-CD45.2⁺CD127⁺GATA3⁺，主要分泌细胞因子IL-5和IL-13；ILC3为lineage^-CD45.2⁺CD127⁺RORγt⁺，主要分泌细胞因子IL-22和IL-17A。


图5. 小肠固有淋巴样细胞分泌细胞因子的能力检测. 所有细胞来自于小肠lineage (CD3，B220，CD11b，CD11c，Gr-1)^-CD45.2⁺CD127⁺活的淋巴细胞群。

固有淋巴样细胞是一群类似于T细胞的固有免疫淋巴细胞群。根据其转录因子的表达情况和细胞因子的分泌能力，可以将固有淋巴样细胞分为ILC1、ILC2、ILC3三群。其中，ILC1与Th1细胞相似，高表达转录因子T-bet且分泌细胞因子IFNγ，可用于杀伤细胞内细菌和抵抗病毒感染。2008~2009年左右发现的ILC2与Th2细胞类似，高表达转录因子GATA3，并能分泌二型细胞因子IL-5、IL-13、IL-4等，参与过敏反应和蠕虫感染的清除 (Sonnenberg和Artis，2015)。此外，中科院邱菊老师实验室和我们实验室共同合作发现ILC2尤其是肺中的ILC2在哮喘或过敏疾病下大量分泌IL-17A，进而加重二型炎症反应 (Cai等，2019)。ILC3则与Th17细胞类似，高表达转录因子RORγt，分泌大量IL-22和IL-17A，进而维持肠道稳态、清除胞外细菌和真菌感染。在图4和图5的结果中，我们分别观察了大小肠中这三类固有淋巴样细胞分泌其代表性细胞因子的能力，其中，大肠所有ILC3中约有46.8%的ILC3可分泌IL-22、16.4%的ILC3可分泌IL-17A；大约有14.2%的ILC1能够大量分泌IFNγ；而分泌IL-5的ILC2占总ILC2的16.2%，表达IL-17 A的ILC2占了ILC2的19.6%。小肠所有ILC1中约有12%的细胞能分泌细胞因子IFNγ，ILC2中约有23.7%的细胞能分泌细胞因子IL-5，ILC3中约有39.3%的细胞能分泌细胞因子IL-22、约有10.8%的ILC3能够分泌IL-17A。

失败经验

无法检测到细胞因子，最重要的原因可能是此次刺激实验无效，可能的原因有：1)刺激剂失效了，需要更换刺激剂，建议染色时加入一个阳性对照的细胞因子作为是否刺激成功的参照；2)细胞状态差，可通过细胞活力以及目的细胞群的细胞数判断此次样本状态好坏，如果取得的总细胞太少或者细胞活率很低，说明此次样本制备失败；3)加入抗体的实验操作有问题。以上问题需要逐步设计实验一一排除。

溶液配方

1. 1x PBS
   用双蒸水稀释20x PBS得到
   室温保存
2. 75%酒精
   取75 ml无水乙醇，用双蒸水定容至100 ml，配成75%酒精
3. 洗液1
   在1x PBS中加入终浓度为1 mM的DTT，即将1M DTT进行1000倍稀释，现配现用
4. 洗液2
   在1x PBS中加入终浓度为30 mM的EDTA，即每10 ml PBS中加入0.6 ml 0.5 M EDTA母液，现配现用
5. 1640完全培养基
   在RPMI 1640培养基中加入终浓度为10%的FBS和1%的P/S
6. DNase I母液
   取1 ml丙三醇溶于9 ml 1x PBS，溶解后0.22 μm过滤
   取6.67 ml过滤后的溶液溶解1 g DNase，常温溶解且尽量不要搅动
   200 μl每管进行分装，可以反复冻融两到三次但不能太多次
7. Collagenase VIII胶原酶母液
   用无血清的RPMI1640培养基室温溶解胶原酶，配成100,000 Units/ml的母液
   需要分装，不能反复冻融
8. 消化液
   在1640完全培养基加入终浓度为150 μg/ml DNase I和100 U/ml (小肠) 或者200 U/ml (大肠) collagenase VIII，即将150 mg/ml DNase I母液1,000倍稀释，100 KU/ml collagenase VIII母液1,000倍或500倍稀释，现配现用
9. 40% percoll
   配4.4 ml 40% percoll需要0.18 ml 10x PBS、1.58 ml percoll、2.64 ml 1640完全培养基，现配现用
10. 80% percoll
    配2.75 ml 80% percoll需要0.22 ml 10x PBS、1.98 ml percoll、0.55 ml 1640完全培养基，现配现用
11. FACS buffer
    在1x PBS中加入终浓度为1%的FBS和2 mM的EDTA
    4 °C保存
12. PMA和离子霉素刺激剂
    PMA母液浓度为20,000x，离子霉素母液浓度为2,000x
    在1.5 ml离心管中加入94.5 μl 1640完全培养基，再加入0.5 μl PMA母液和5 μl离子霉素母液，充分混匀
    注: 操作这两种刺激剂需要避光，且避免反复冻融。
13. PMA母液
    将1 mg PMA室温溶解于1 ml DMSO中，得到20,000x的母液
14. 离子霉素母液
    将1 mg离子霉素室温溶解于1 m lDMSO中，得到2,000x的母液
15. 细胞活力染料溶液
    一个样品需要100 μl，取100 μl 1x PBS加入0.1 μl细胞活力染料Fixable Viability Stain 520 (FITC)，1:1000稀释，现用现配，注意避光
16. CD16/32 block染料抗体
    一个样品需要50 μl，取50 μl FACS buffer 加入0.5 μl TruStainfcX^TM (anti-mouse CD16/32) 配成block 溶液，1:100稀释，现用现配，注意避光
17. 抗体混合物溶液
    染色反应总体积为100 μl，包括50 μl CD16/32 block染料抗体和50 μl抗体混合物溶液。因此，取43 μl FACS buffer各加入0.5 μl前文出现的所有表面抗体配成抗体混合物溶液 (包括5种lineage抗体和CD45.2、CD127等7种抗体共3.5 μl)，1:200稀释，现用现配，注意避光
18. Foxp3 Fixation/Permeabilization working solution
    将1份Fixation/Permeabilization Concentrate和3份Fixation/Permeabilization Diluent充分混匀，现配现用
19. 1x Permeabilization Buffer
    用双蒸水稀释，10倍稀释10x Permeabilization Buffer，现配现用
    

致谢

感谢沈蕾实验室和中科院邱菊实验室各位研究生同学对本实验方法的帮助和改进。本实验得到国家自然科学基金项目 (81571533) 的资助。

参考文献

1. Cai, T., Qiu, J., Ji, Y., Li, W., Ding, Z., Suo, C., Chang, J., Wang, J., He, R., Qian, Y., Guo, X., Zhou, L., Sheng, H., Shen, L. and Qiu, J. (2019). IL-17-producing ST2(+) group 2 innate lymphoid cells play a pathogenic role in lung inflammation. J Allergy Clin Immunol 143(1): 229-244 e229.
2. Sonnenberg, G. F. and Artis, D. (2015). Innate lymphoid cells in the initiation, regulation and resolution of inflammation. Nat Med 21(7): 698-708.