Flow Cytometry of Intestinal Mononuclear Phagocytic Subsets and Functions

研究背景：肠道固有层单核吞噬细胞包括巨噬细胞和常规树突状细胞 (conventional dendritic cells, cDCs)，在肠道黏膜稳态、感染和炎症中起重要作用 (Joeris等，2017)。和其他组织一样，肠道固有层巨噬细胞高表达表面抗原F4/80及CD11b，依据其表面趋化因子受体CX3CR1表达水平和功能的不同可分为炎性巨噬细胞 (inflammatory macrophages, IMs) 和驻留巨噬细胞 (resident macrophages, RMs) (Grainger等，2017)。前者低表达或中度表达CX3CR1，产生肿瘤坏死因子α (TNF-α)、白介素1β (IL-1β)、白介素6 (IL-6) 和诱导型一氧化氮合酶 (iNOS)，具有强烈的促炎特性，负责招募炎性免疫细胞 (如中性粒细胞) 至病变部位，同时也可限制中性粒细胞功能，防止炎症过度激活放大 (Grainger等，2017)。后者高表达CX3CR1，具有很强的吞噬活性，同时分泌较多白介素10 (IL-10) 及少量TNF-α，维持局部Treg数量，参与组织修复及上皮再生 (Grainger等，2017；Joeris等，2017)。同样，肠道固有层cDCs也高表达主要组织相容性复合物II (MHC-II) 和表面分子CD11c。尽管肠道cDCs有很多种分类方法 (周光炎，2013；Si等，2016；Joeris等，2017)，但依据功能不同主要分为效应性DCs和调节性DCs (周光炎，2013)。前者表达表面分子CD11b及CX3CR1，分泌白介素12 (IL-12)、TNF-α等，激活Th1细胞及Th17细胞，诱导保护性炎症反应；后者表达整合素αE (CD103)，不表达CX3CR1，分泌IL-10、TGF-β，激活FoxP3⁺Treg，抑制机体对抗原和共生菌的应答 (周光炎，2013)。在此，我们构建一套10色16参数的流式方案，首先通过FSC-A/SSC-A圈出淋巴细胞，去除细胞碎片及粘连体。通过LIVE/DEAD和CD45.2圈出活的CD45.2⁺免疫细胞，并使用Linage (CD3，B220，GR-1) 去除T细胞、B细胞、粒细胞，以减少干扰。接着将F4/80+CD11b+细胞定义为巨噬细胞，根据CX3CR1的表达，将巨噬细胞分为IMs (F4/80⁺CD11b⁺CX3CR1^-/int)和RMs (F4/80⁺CD11b⁺CX3CR1^hi)；同时将F4/80^-MHC-II⁺CD11c⁺细胞定义为cDCs，cDCs可进一步分为两个亚群：调节性DCs (CD103⁺CX3CR1^-) 和效应性DCs (CD11b⁺CX3CR1⁺)。在这套流式方案里，我们还加入了细胞因子 (IL-10，TNF-α) 以检测巨噬细胞细胞因子分泌情况。
        总之，我们描述了肠道固有层单核吞噬细胞的获取方法并提出一项10色16参数的流式方案，将有助于分离和定义肠道巨噬细胞和cDCs这两个群体，以便进一步的表型分析和功能表征。

材料与试剂

耗材：

1. 1.5 ml尖底离心管 (Axygen, catalog number: MCT-150-C)
2. 5 ml带盖离心管 (Axygen, catalog number: SCT-5ML-S)
3. 15 ml尖底离心管 (Corning, catalog number: 430791)
4. 50 ml尖底离心管 (Corning, catalog number: 430829)
5. 3 ml圆头吸管 (Biologix, catalog number: 30-0138A1)
6. 10 μl移液器吸头 (Axygen, catalog number: T-300)
7.  200 μl移液器吸头 (Axygen, catalog number: T-200-Y)
8. 1,000 μl移液器吸头 (Axygen, catalog number: T-1000-B)
9. 10 ml移液管 (Corning, catalog number: 4488)
10. 90 cm培养皿 (Bioinspl, catalog number: GD9100)
11. 6孔板 (Corning, catalog number: 3516)
12. 96孔板 (Corning, catalog number: 3360)
13. 5 ml Falcon聚苯乙烯圆底管 (Corning, catalog number: 352052)
14. 70 μm滤器 (Corning, catalog number: 352350)
15. 0.22 μm滤器 (Millipore, catalog number: SLGP033RB)
16. 剪刀 (苏州施强医疗器械有限公司，catalog number: JYJ1030D)
17. 镊子 (苏州施强医疗器械有限公司，catalog number: JYN1020)
18. 细胞计数板 (Marienfeld, catalog number: 0650030)

SPF级野生型C57BL/6雄性小鼠 (上海灵畅实验动物有限公司)，8~10w，饲养于屏障温控房，12 h昼夜交替，温度20~22 °C，湿度30%~70%。所有实验均经上海交通大学医学院动物护理与使用委员会批准

 抗体：

1. 抗CD16/32 (克隆号：93，BioLegend，catalog number: 101320，工作稀释度1/50)
2. 抗CD45.2 (克隆号：104，eBioscience，catalog number: 56-0454-82，工作稀释度1/200)
3. 抗CD3e (克隆号：145-2C11，BD Biosciences，catalog number: 557596，工作稀释度1/200)
4. 抗B220 (克隆号：RA3-6B2，BD Biosciences，catalog number: 552094，工作稀释度1/200)
5. 抗Gr-1 (克隆号：RB6-8C5，BioLegend，catalog number: 108424，工作稀释度1/200)
6. 抗F4/80 (克隆号：BM8，eBioscience，catalog number: 17-4801-82，工作稀释度1/200)
7. 抗CD11b (克隆号：M1/70，BioLegend，catalog number: 101256，工作稀释度1/200)
8. 抗CX3CR1 (克隆号：SA011F11，BioLegend，catalog number: 149023，工作稀释度1/200)
9. 抗MHC-II (克隆号：AF6-120.1，eBioscience，catalog number: 11-5320-82，工作稀释度1/200)
10. 抗CD11c (克隆号：HL3，BD Biosciences，catalog number: 558079，工作稀释度1/200)
11. 抗CD103 (克隆号：M290，BD Biosciences，catalog number: 564322，工作稀释度1/200)
12. 抗IL-10 (克隆号：JES5-16E3，BD Biosciences，catalog number: 563277，工作稀释度1/100)
13. 抗TNF-α (克隆号：MP6-XT22，eBioscience，catalog number: 12-7321-82，工作稀释度1/100)
    

1. 胎牛血清 (FBS, Lonsera, catalog number: S711-001S)
2. 胶原酶VIII (Collagenase VIII, Sigma-Aldrich, catalog number: C2139)
3. 脱氧核糖核酸酶I (DNase I, Sigma-Aldrich, catalog number: DN25)
4. 二硫苏糖醇 (DTT, Sigma-Aldrich, catalog number: D9779)
5. 乙二胺四乙酸二钠盐二水 (Na₂EDTA·2H₂O，上海生工，catalog number: 205-358-3)
6. 氯化钠 (NaCl，上海生工，catalog number: 7647-14-5)
7. 磷酸氢二钠十二水 (Na₂HPO₄·12H₂O，上海生工，catalog number: 10039-32-4)
8. 无水磷酸二氢钾 (KH₂PO₄，上海生工，catalog number: 7778-77-0)
9. N-(2-羟乙基)哌秦-N'-2-乙烷磺酸 (HEPES, Biosharp, catalog number: BS029C)
10. RPMI 1640 (GE, catalog number: SH3080901)
11. Percoll细胞分离液 (GE, catalog number: 17-0891-011) 
12. Brefeldin A Solution (BFA，BioLegend，catalog number: 420601，工作稀释度1/1000)
13. Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set(eBioscience, catalog number: 00-5523-00)
14. LIVE/DEAD™ Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit-APC-Cy7 (eBioscience，catalog number: L10119，工作稀释度1/1000)
15. Fixation/Permeabilization原液
16. Fixation/Permeabilization稀释液
17. 台盼蓝溶液
18. NaOH
19. 丙三醇
20. 1x PBS缓冲液 (见溶液配方)
21. 10x PBS缓冲液 (见溶液配方)
22. 1000x DTT溶液 (见溶液配方)
23. 0.5 M EDTA (pH 8.0) 溶液 (见溶液配方)
24. 1 M HEPES溶液 (见溶液配方)
25. 解离液1 (见溶液配方)
26. 解离液2 (见溶液配方)
27. 胶原酶VIII母液 (见溶液配方)
28. DNA酶 I母液 (见溶液配方)
29. 消化液 (见溶液配方)
30. 含10%FBS的RPMI1640培养液 (见溶液配方)
    
31. 40% Percoll溶液 (见溶液配方)
32. 80% Percoll溶液 (见溶液配方)
33. 细胞死活染料工作液 (见溶液配方)
34. FACS缓冲液 (见溶液配方)
35. Fc block工作液 (见溶液配方)
36. 细胞表面抗原抗体混合液 (见溶液配方)
37. Fixation/Permeabilization工作液 (见溶液配方)
38. Permeabilization洗液工作液 (见溶液配方)
39. 细胞胞内抗原抗体混合液 (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 高压蒸汽灭菌锅 (TOMY, model: SX-500)
2. 超净工作站 (Thermo Scientific, model: 1300SERIESA2)
3. 台式恒温振荡器摇床 (上海智城，model: ZWY-200D)
4. 冷冻台式离心机 (Thermo Scientific, model: SORVALL ST40R)
5. CO₂培养箱 (Thermo Scientific, model: HERACELL 150i)
6. 倒置相差显微镜 (Olympus, model: CKX41)
7. -20 °C低温冰箱 (Haier, model: DW25L262)
8. 4 °C冰箱 (Haier, model: HYC-940)
9. 流式分析仪 (BD, model: LSRFortessa)
10. 磁力搅拌器
    

实验步骤

一. 小鼠肠固有层淋巴细胞制备

1. 颈椎脱臼法处死小鼠，75%酒精喷洒小鼠腹部消毒，于正中纵行剪开腹腔。
2. 小肠上端至胃的幽门，下端至回盲瓣，剥离小肠上的肠系膜即周围组织，然后从腹腔内将小肠完全取出；盲肠下端到肛门为止为大肠，剥离肠系膜及周围组织后取出整个大肠。
3. 将取出的小肠及大肠分别浸泡在装有4 ml PBS缓冲液 (1x，如无特别说明，后续PBS均为1x) 的15 ml离心管中，并置于冰上。
4. 将小肠及大肠置于含适量PBS缓冲液的培养皿上，小心的用镊子剥离肠壁上的脂肪，用剪刀剪去派伊尔氏结。
5. 将小肠肠壁沿肠系膜纵行剪开，在PBS缓冲液内涮洗去除肠腔内的污物。大肠处理步骤同小肠类似，但大肠无派伊尔氏结。
6. 分别将小肠及大肠转移至含7 ml PBS缓冲液的15 ml离心管中，转移时剪成大小适宜的小段 (1.5~2 cm)，盖紧盖子快速人工上下剧烈振荡2分钟 (视频1)。
   
   
   

   视频1. 步骤6人工振荡频率示意视频
   
   
7. 将用PBS缓冲液洗过的肠段转移至含10 ml解离液1 (详见溶液配方) 的50 ml离心管中，直立放于台式恒温振荡器摇床中37 °C下250 rpm水平振荡10分钟，完成后快速人工上下剧烈振荡2分钟 (图1，视频2)。
   
   
   图1. 解离液1处理后小肠及大肠状态图. A. 小肠。B.大肠。
   
   
8. 将肠段转移至含10 ml解离液2 (详见溶液配方) 的50 ml离心管中，直立放于台式恒温振荡器摇床中37 °C下250 rpm水平振荡10分钟。完成后快速上下剧烈振荡2分钟。重复此步骤1次 (图2，视频2)。
   
   
   图2. 解离液2处理后小肠及大肠状态图. A. 小肠。B.大肠。
   
   
   
   视频2. 步骤7~8人工振荡频率示意视频
   
   
9. 将解离后的肠段转移至装有4 ml含10% FBS的RPMI1640培养液 (详见溶液配方) 的15 ml离心管中，上下颠倒2分钟 (此步应缓慢轻柔)。把肠段转移至已加入了消化液 (详见溶液配方) 的6孔板中，在转移时把肠段剪成更小 (<0.5 cm) 的碎片，小肠消化体系为4 ml，大肠为3 ml，放置于5% CO₂培养箱37 °C下消化90分钟 (图3)。
   
   
   图3. 消化液处理后小肠及大肠状态图. A. 小肠。B.大肠。
   
   
10. 消化完成后，用吸管将消化后的组织块连同消化液转移至15 ml离心管中，加PBS缓冲液定容至7 ml。快速人工上下剧烈振荡2分钟后，消化液过70 μm滤器至15 ml离心管中，定容至14 ml，500 x g，室温离心5分钟。
11. 用4 ml的40% Percoll溶液 (详见溶液配方) 重悬细胞沉淀，将2.5 ml的80% Percoll溶液 (详见溶液配方) 用滴管加至离心管底部，1000 x g室温离心20分钟 (升1降0或升5降1)。离心完成后先吸去上层的杂质，再用滴管小心的吸出中间层的细胞沉淀于15 ml离心管中，用PBS缓冲液定容至14 ml，800 x g室温离心10分钟 (图4，视频3)。
    
    
    图4. Percoll离心之后的分层情况
    
    
    
    视频3. 弃去上层杂质，吸取中间免疫细胞层
    
    
12. 离心完成后，用500 μl含10% FBS的RPMI1640培养液重悬细胞沉淀。取10 μl分离所得的单细胞悬液，加入10 μl台盼蓝溶液，置于倒置相差显微镜下测细胞活力并细胞计数。细胞计数公式为：镜下计数 × 10⁴ × 2 × 单细胞悬液体积。

用适量含10% FBS的RPMI1640培养液 (详见溶液配方) 重悬细胞沉淀，调整最终细胞浓度至5 × 10⁶/ml，取200 μl转移至96孔板，每样本加入10 μg/ml BFA置于5% CO₂培养箱中37 °C培养4小时，阻断细胞因子分泌到细胞外。

三.用于流式分析的细胞染色

1. 将上述培养好的细胞于室温下400 x g离心5分钟，吸去上清 (注意在侧壁吸取，防止吸走细胞)，留细胞沉淀；
2. 每孔 (以下均为每孔) 加入100 μl细胞死活染料工作液 (详见溶液配方) 重悬细胞沉淀 (轻轻吹打混匀，不要产生气泡)，室温避光孵育20分钟；
3. 孵育结束后加入150 μl PBS缓冲液室温下400 x g离心5分钟，吸去上清，留细胞沉淀；
4. 加入40 μl Fc block工作液 (详见溶液配方) 重悬细胞沉淀，4 °C避光孵育10分钟 (或室温5分钟)，阻断非特异性Fc介导的相互作用；
5. 孵育结束后无需清洗，直接加入20 μl表面抗原抗体混合液 (详见溶液配方)，轻轻吹打混匀细胞，4 °C避光孵育30分钟；
6. 孵育结束后加入150 μl FACS缓冲液 (详见溶液配方)，室温下400 x g离心5分钟，吸去上清，留细胞沉淀；
7. 加入80 μl的Fixation/Permeabilization工作液 (详见溶液配方) 重悬细胞沉淀，4 °C避光孵育45~60分钟 (或过夜)；
8. 孵育结束后加入150 μl Permeabilization洗液 (详见溶液配方)，室温下500 x g离心5分钟，吸去上清，留细胞沉淀；
9. 加入50 μl细胞内抗原抗体混合液 (详见溶液配方)，重悬细胞，4 °C避光孵育45~60分钟；
10. 孵育结束后加入200 μl Permeabilization洗液，室温下500 x g离心5分钟，吸去上清，留细胞沉淀；
11. 加入200 μl FACS缓冲液重悬细胞沉淀，70 μm滤器过滤后转移至流式管，再加入100 μl FACS缓冲液混匀后等待上机进行流式分析，若暂时不上机，请置于4 °C冰箱保存，保存时间建议不超过24小时。

样本由BD LSRFortessa流式细胞仪检测。每个样本收集总Events数量为300,000个。采用FlowJo 10.5.3软件分析，设门方法见图5。首先通过FSC-A/SSC-A圈出淋巴细胞，去除细胞碎片及粘连体。通过LIVE/DEAD和CD45.2圈出活的CD45.2⁺免疫细胞，并使用Linage (CD3,B220,GR-1) 去除T细胞、B细胞、粒细胞，以减少干扰。接着将F4/80⁺CD11b⁺细胞定义为巨噬细胞，根据CX3CR1的表达，将巨噬细胞分为IMs (F4/80⁺CD11b⁺CX3CR1^-/int) 和RMs (F4/80⁺CD11b⁺CX3CR1^hi)；同时将F4/80^-MHC-II⁺CD11c⁺细胞定义为cDCs，根据CD103、CX3CR1和CD11b的表达情况 ，cDCs进一步分为两个亚群：调节性DCs (CD103⁺CX3CR1^-) 和效应性DCs (CD11b⁺CX3CR1⁺)。最后分别从IMs和RMs细胞中检测IL-10及TNF-α的表达。
        设门结束后记录各细胞群的细胞比例及Count。最后分析巨噬细胞亚群分泌IL-10和TNF-α的比例。各细胞群细胞绝对数 = (各细胞群Count)/(Total Count) × 细胞计数。Total Count是指流式软件中指除去死细胞及碎片外的所有Count，细胞计数是指各样本单细胞悬液总活细胞数。


图5. 肠道固有层单核吞噬细胞设门策略. A. 大肠固有层单核吞噬细胞设门策略；B. 小肠固有层单核吞噬细胞设门策略。Lin，Linage (CD3,B220,GR-1)；LivenonTBG CD45.2⁺Cells，除T、B、粒细胞之外活的免疫细胞；Macs,Macrophages，巨噬细胞；IMs,inflammatory macrophages，炎性巨噬细胞；RMs,resident macrophages，驻留巨噬细胞；DCs，树突状细胞；effector DCs，效应性DCs；Regulatory DCs，调节性DCs.

结果与分析

使用该Protocol可从7~8周龄雄性C57BL/6小鼠小肠中获取的活细胞平均数量约为4~6 × 10⁶个细胞，大肠的平均活细胞数约为3~5 × 10⁶，死亡细胞比例小于10%。在排除T、B及粒细胞干扰后，在剩余所有肠道CD45.2⁺活细胞中，小肠有 (9.556 ± 0.465)%的DCs，其中，CD11b⁺CX3CR1⁺DCs占 (19.460 ± 3.883)%， CD103⁺CX3CR1^-DCs的比例为 (58.18 ± 5.538)%；小肠Macs约占CD45.2⁺Lin^-活细胞的 (7.258 ± 1.104)%，其中，IMs的比例为 (58.700 ± 11.260)%，RMs的比例为 (40.160 ± 11.180)%。大肠单核吞噬细胞比例总体上和小肠类似，但RMs略多。大肠有 (8.392 ± 0.6873)%的CD45.2⁺Lin^-活细胞是DCs，其中，CD11b⁺CX3CR1⁺DCs约占 (11.020 ± 2.220)%，CD103⁺CX3CR1^-DCs的比例为 (60.020 ± 5.056)%；而Macs在CD45.2⁺Lin^-活细胞比例为 (8.833 ± 0.9149)%，其中，IMs占 (36.900 ± 5.298)%，RMs为 (61.420 ± 5.513)%。稳态情况下，平均不到 (6.758 ± 2.216)%的小肠IMs分泌TNF-α，其分泌IL-10的比例更低，为 (1.576 ± 0.2485)%；然而，平均有 (11.010 ± 1.873)%的RMs分泌IL-10，(38.660 ± 4.933)%的RMs分泌TNF-α。大肠巨噬细胞分泌IL-10及TNF-α的情况和小肠类似。由此可见，稳态下，肠道巨噬细胞处于激活状态的主要是RMs，这也间接提示RMs是维持肠道稳态的主要巨噬细胞。

失败经验

1. 可能犯错的步骤或失败的经验
   解离液2清洗步骤未重复、人工振荡步骤用力过小、向40% Percoll细胞分离液中添加80% Percoll细胞分离液时用力过猛，均可能导致分离获取的肠道固有层单个核细胞数量明显减少。

2. 补救经验
    严格执行实验步骤一(8)；人工振荡步骤用力适中；向40% Percoll细胞分离液中添加80% Percoll细胞分离液时用力轻柔。

溶液配方

1. 10x PBS缓冲液 
   NaCl 90 g
   Na₂HPO₄·12H₂O 12 g
   KH₂PO₄ 1.44 g
   加双蒸水800 ml，置于磁力搅拌器用磁力搅拌子搅拌溶解，然后用双蒸水定容至1,000 ml，无需调节pH值，分装后121 °C高压灭菌30分钟，4 °C保存
2. 1x PBS缓冲液 
   PBS缓冲液 (10x) 100 ml加入无菌三蒸水900 ml，混匀后4 °C保存
3. 1000x DTT溶液
   DTT 1 g溶于6.483 ml无菌三蒸水，配成1 M 母液
   通过0.22 μm滤器过滤除菌后分装成200 μl每管，-20 °C保存
4. 0.5 M EDTA (pH8.0) 溶液 (1L)
   在800 ml去离子水中加入186.1 g Na₂EDTA·2H₂O
   在磁力搅拌器上40 °C加温搅拌溶解
   用NaOH调节溶液的pH值至8.0 (约需20 g NaOH颗粒)，然后稀释至1 L
   分装后121 °C高压灭菌30分钟备用，4 °C保存
5. 1 M HEPES溶液 (100 ml)
   将23.8 g HEPES溶于约90 ml的去离子水中
   用NaOH调节溶液的pH值至8.0，然后用水定容至100 ml
   121 °C高压灭菌30分钟，4 °C保存
6. 解离液1
   每10 ml PBS缓冲液 (1x) 加1 mM DTT和10 mM HEPES (pH 8.0)
   混匀后室温保存，每样本需10 ml解离液1
7. 解离液2
   每10 ml PBS缓冲液 (1x) 加30 mM EDTA (pH 8.0) 和10 mM HEPES (pH 8.0)
   混匀后室温保存，每样本需10 ml解离液2
8. 含10% FBS的RPMI 1640培养液
   以50 ml为例，45 ml RPMI 1640加入FBS 5 ml，混匀后4 °C保存
9. 胶原酶VIII母液
   取1 g Collagenase VIII (效价为801 CDU/mg) 加入8.01 ml无菌不含血清的RPMI 1640，母液浓度为100 kU/ml
   通过0.22 μm过滤器过滤除菌后分装成500 μl每管，-20 °C保存
10. DNA酶I母液 (1000X)
    1 ml丙三醇加入9 ml PBS缓冲液配制溶剂，0.22 μm过滤器过滤除菌
    取6.67 ml过滤过的溶剂加到Dnase I (1 g) 的瓶子里 (固体很蓬松、溶解很粘稠，尽量不要搅动让其自然溶解，不然容易沾到枪头上，造成损失)，母液浓度为150mg/ml，分装成200 μl每管，-20 °C保存
11. 消化液
    小肠消化液：在含10% FBS的RPMI 1640中加入100~200 U/ml Collagenase VIII (Collagenase VIII浓度需根据其效价及小鼠的品系、肠道长度进行调整)，0.15 mg/ml DNase I，混匀后在室温下静置至少5 min后使用，体系为4 ml/样本
    大肠消化液：在10% FBS的RPMI 1640中加入200~400 U/ml Collagenase VIII (Collagenase VIII浓度需根据其效价及小鼠的品系、肠道长度进行调整)，0.15 mg/ml DNase I，混匀后在室温下静置至少5 min后使用，体系为3 ml/样本
12. 40% Percoll溶液
    Percoll细胞分离液与PBS缓冲液 (10x) 按体积比9:1混合，配制等渗100% Percoll母液
    用100% Percoll母液和RPMI 1640按体积比4:6混合，配制40%等渗Percoll溶液
13. 80% Percoll溶液
    Percoll细胞分离液与PBS缓冲液 (10x) 按体积比9:1混合，配制等渗100% Percoll母液
    用100% Percoll母液和RPMI 1640按体积比8:2混合，配制80%等渗Percoll溶液
14. 细胞死活染料工作液
    LIVE/DEAD™ Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit按说明书配制1000x细胞死活染料母液
    用PBS缓冲液 (1x) 按1:1000稀释细胞死活染料母液，混匀后4 °C保存，100 μl/样
15. FACS缓冲液
    以50 ml为例， 0.5 ml FBS和0.1 ml EDTA (0.5 M，pH 8.0) 加入50 ml PBS缓冲液 (1x) 中，混匀后4 °C保存
16. Fc block工作液
    用FACS缓冲液按1:50稀释抗CD16/32抗体
    混匀后4 °C保存，40 μl/样
17. 细胞表面抗原抗体混合液 (以下抗体用于制备细胞表面抗原抗体混合液)
    抗CD45.2-Alexa Fluor700 (克隆号：104)
    抗CD3e-APC-Cy7 (克隆号：17A2)
    抗B220-APC-Cy7 (克隆号：RA3-6B2)
    抗Gr-1-APC-Cy7 (克隆号：RB6-8C5)
    抗F4/80-APC (克隆号：BM8)
    抗CD11b-PE/Dazzle™ 594 (克隆号：M1/70)
    抗CX3CR1-BV421 (克隆号：SA011F11)
    抗MHC-II-FITC (克隆号：AF6-120.1)
    抗CD11c-PE-Cy7 (克隆号：HL3)
    抗CD103-BV786 (克隆号：M290)
    将上述抗体按1:200依次加入FACS缓冲液中，混匀后4 °C保存，20 μl/样
18. Fixation/Permeabilization工作液
    Fixation/Permeabilization原液用Fixation/Permeabilization专用稀释液稀释 (Fixation/Permeabilization原液:Fixation/Permeabilization专用稀释液稀释 = 1:3)，混匀后4 °C保存，80 μl/每样
19. Permeabilization洗液工作液
    Permeabilization洗液原液用三蒸水稀释 (Permeabilization洗液原液:三蒸水 = 1:9)，4 °C保存
20. 细胞胞内抗原抗体混合液 (以下抗体用于制备细胞胞内抗原抗体混合液)
    抗IL-10-BV510 (克隆号：JES5-16E3)
    抗TNF-α-PE (克隆号：MP6-XT22)
    将上述抗体按1:100依次加入Permeabilization洗液中，混匀后4 °C保存，50 μl/样
    

致谢

感谢上海市免疫学研究所沈蕾实验室提供实验场所，以及实验室各位研究生同学对本实验方法的帮助及改进。这项工作得到了国家自然科学基金项目 (81571943，81571533，81873944) 的支持。

参考文献

1. 周光炎 (2013).免疫学原理(第三版). 科学出版社.
2. Grainger, J. R., Konkel, J. E., Zangerle-Murray, T. and Shaw, T. N. (2017). Macrophages in gastrointestinal homeostasis and inflammation. Pflugers Arch 469(3-4): 527-539.
3. Joeris, T., Muller-Luda, K., Agace, W. W. and Mowat, A. M. (2017). Diversity and functions of intestinal mononuclear phagocytes. Mucosal Immunol 10(4): 845-864.
4. Si, C., Zhang, R., Wu, T., Lu, G., Hu, Y., Zhang, H., Xu, F., Wei, P., Chen, K., Tang, H., Yeretssian, G. and Xiong, H. (2016). Dendritic cell-derived nitric oxide inhibits the differentiation of effector dendritic cells. Oncotarget 7(46): 74834-74845.