Analyzing Cytokines Production during T Cell Activation by Flow Cytometry Intracellular Staining

材料与试剂

1. 96孔板 (Jet Biofil, catalog number: TCP001096)
2. OT-I小鼠 (Jackson Lab)
3. Anti-mCD8-AF700 (BioLegend, catalog number: 100730)
4. Anti-IFN-γ-APC (BioLegend, catalog number: 505810)
5. anti-CD16/32 抗体 (clone 2.4G2) (BioLegend, catalog number: 101301)
6. B16-OVA细胞 (芝加哥大学Hans Schreiber馈赠)
7. FBS (Gibco, catalog number: 10270-106)
   
8. PBS (Hyclone, catalog number: SH30256.01B)
9. RPMI 1640培养基 (Hyclone, catalog number: SH30027.01)
10. 双抗Penicillin/Streptomycin (Hyclone, catalog number: SV30010)
11. 10x Permeabilization Buffer (eBioscience, catalog number: 00-8333-56)
12. BFA (Brefeldin A) (BioLegend, catalog number: 420601)
13. 多聚甲醛 (Adamas, catalog number: 46556A)
14. NaCl (Sigma-Aldrich, catalog number：V900058-500g)
15. KCl (Sigma-Aldrich, catalog number：V900068-500g)
16. Na₂HPO₄ (Sigma-Aldrich, catalog number：V900060-500g)
17. KH₂PO₄ (Sigma-Aldrich, catalog number：V900041-500g)
18. NaN₃ (Amresco, catalog number: 0639-250g)
19. NaOH (Sigma-Aldrich, catalog number: V900797)
20. 10× PBS (1 L, pH = 7.3) (见溶液配方)
21. FACS buffer (见溶液配方)
22. 4%多聚甲醛 (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 生物安全柜 (LabGard, model: Class II/Labconco) 
2. 离心机 (Eppendorf, model: 5810R) 
3. 光学显微镜 (Olympus, model: IX2-SLP)
4. 流式细胞仪 (Backman Coulter, model: CytoFLEX S)
5. 移液器 (Eppendorf)
6. 二氧化碳培养箱 (Panasonic, model: MCO-20AIC)
7. 高压蒸汽灭菌锅 (Boxun，model: YXQ-LS-100SII)
   

软件

1. FlowJo 软件

实验步骤

1. 获取OT-I小鼠的脾脏细胞，计数，按照1 × 10⁵~2 × 10⁵接种于96孔板，培养基为含IL-2的RPMI完全培养基，按照 (OT-I小鼠的脾脏细胞:B16-OVA肿瘤细胞) E:T = 3:1的比例加入B16-OVA肿瘤细胞刺激，对照组不加肿瘤细胞；
2. 刺激后约20 h，加入BFA反应2.5 h~4 h，用排枪吸取悬浮细胞悬液加入新的96孔板 (U型)，500 x g离心3 min，弃去上清；
3. 加入FACS buffer，200 μl/sample，500 x g离心3 min，弃去上清；
4. 细胞表面分子染色，单份样品抗体用量如下，按照50 μl/sample加入样品，适度混匀，4 °C孵育25 min：
   25 μl FACS buffer
   25 μl 2.4G2 (200 ng/ml)
   0.15 μl anti-mCD8-AF700;
5. 加入FACS buffer 150 μl/sample，500 x g离心3 min，弃去上清；
6. 重复第5步；
7. 细胞固定，按照100 μl/sample标准加入4% PFA固定，加入后立即使用移液器反复吹打混匀防止细胞结块，室温孵育15 min；
8. 加入FACS buffer 150 μl/sample，500 x g离心3 min，弃去上清；
9. 重复第8步；
10. 破膜处理，新鲜配制1× Permeabilization Buffer，按照200 μl/sample加入1× Permeabilization Buffer，用移液器吹打重悬细胞，室温15 min，破膜完成后，500 x g，离心3 min，去上清；
11. 胞内细胞因子染色，单份样品抗体用量如下，并按照50 μl/sample加入样品，适度混匀，4 °C孵育25 min：
    50 μl 1x Permeabilization Buffer
    0.15 μl anti-IFN-γ-APC;
12. 加入1× Permeabilization Buffer 150 μl/sample，500 x g离心3 min，弃去上清；
13. 用FACS buffer 重悬样品 (70 μl/sample)，将样品置于冰上；
14. 使用流式细胞仪分析获取数据，利用FlowJo 软件分析流式检测结果。
    

结果与分析

胞内染色法检测T细胞活化引起的IFN-γ的表达情况

结果分析：图1A通过FSC-A和SSC-A分析排除死细胞和细胞碎片，确定和收集主要细胞群；图1B进一步通过APC-A700-A染色确定CD8+ T细胞；图1C~1D在图1B基础上通过APC-A染色确定IFN-γ的表达。


图1. 胞内染色检测活化T细胞释放IFN-γ的情况

注意事项

1. 该实验中的200 ng/ml为2.4G2抗体最终浓度；抗体Anti-mCD8-AF700及Anti-IFN-γ- APC具有光谱重叠需要预先在流式细胞仪上调好补偿，多色共染时对于抗体的选择需要注意，要尽量减少光谱重叠，例如两色共染时可选择APC + FITC标记或者APC + AF488标记，这样可以有效避免光谱重叠。
2. 本实验中也可以收集24 h时细胞上清，利用ELISA或CBA的方法检测上清中分泌IFN-γ的表达，胞内染色的优点在于能够明确产生IFN-γ的细胞类型，此外，其他效应分子如Granzyme B、Perforin及TNF-α等也可以用同样的胞内染色方法进行流式检测。
   

溶液配方

1. 10× PBS (1 L, pH=7.3)
   

   NaCl	80 g
   KCl	10 g
   Na2HPO4	14.4 g
   KH2PO4	2.4 g

   将上述试剂加入800 ml ddH₂O依次进行溶解，待所有试剂完全溶解后，高温湿热灭菌，冷却后室温保存待用
2. FACS buffer
   

   10× PBS	100 ml
   FBS	10 ml
   20% NaN3	2.5 ml

   使用量筒取100 ml 10× PBS，首先加入800 ml ddH₂O进行稀释，再加入10 ml FBS和2.5 ml 20% NaN₃，混合均匀后，加入ddH₂O定容至1 L，4 °C备用
3. 4%多聚甲醛
   

   多聚甲醛	4.0 g
   PBS	100 ml

   称量4.0 g多聚甲醛，先加入80 ml已配制好的1× PBS在60~65 °C加热搅拌溶解，20分钟后，使用NaOH调节pH至7.0，待溶液呈现清亮，无未溶解固体成分，加入PBS定容至100 ml，避光保存于4 °C待用
   注：甲醛具有较强的毒性，注意做好防护措施。
   

致谢

感谢杨选明实验室全体成员的建议和帮助。该研究受国家自然基金 (81671643)、科技部重点研发计划 (2016YFC1303400) 资助。本实验方案用于已发表的文章Han 等，2019；Qi等，2019；Zhang等2019。

参考文献

1. Han, P., Dai, Q., Fan, L., Lin, H., Zhang, X., Li, F. and Yang, X. (2019). Genome-wide CRISPR screening identifies JAK1 deficiency as a mechanism of T-Cell resistance. Front Immunol 10: 251.
2. Pu, Y., Xu, M., Liang, Y., Yang, K., Guo, Y., Yang, X. and Fu, Y. X. (2016). Androgen receptor antagonists compromise T cell response against prostate cancer leading to early tumor relapse. Sci Transl Med 8(333): 333ra347.
3. Qi, X., Li, F., Wu, Y., Cheng, C., Han, P., Wang, J. and Yang, X. (2019). Optimization of 4-1BB antibody for cancer immunotherapy by balancing agonistic strength with FcgammaR affinity. Nat Commun 10(1): 2141.
4. Yang, X., Zhang, X., Fu, M. L., Weichselbaum, R. R., Gajewski, T. F., Guo, Y. and Fu, Y. X. (2014a). Targeting the tumor microenvironment with interferon-beta bridges innate and adaptive immune responses. Cancer Cell 25(1): 37-48.
5. Yang, X., Zhang, X., Sun, Y., Tu, T., Fu, M. L., Miller, M. and Fu, Y. X. (2014b). A BTLA-mediated bait and switch strategy permits Listeria expansion in CD8α(+) DCs to promote long-term T cell responses. Cell Host Microbe 16(1): 68-80.
6. Zhang, X., Cheng, C., Hou, J., Qi, X., Wang, X., Han, P. and Yang, X. (2019). Distinct contribution of PD-L1 suppression by spatial expression of PD-L1 on tumor and non-tumor cells. Cell Mol Immunol 16(4): 392-400.