Functional Analysis of Mouse Tregs by Flow Cytometry Analysis

材料与试剂

一、小鼠淋巴结、脾脏单细胞悬液制备相关耗材及试剂

1. 移液枪头
2. 6 cm平皿 (NEST, catalog number: 110001)
3. 15 ml聚丙烯离心管 (康宁, catalog number: 352096)，1.5 ml离心管 (国产)
4. 200目白色尼龙网 (达科为, catalog number: DKW33-N25)
5. 0.22 μm无菌滤膜 (Millipore, catalog number: SLGP033RB)
6. 6至8周龄大小的C57/BL6，Foxp3-GFP KI品系小鼠
7. 75%酒精
8. 1x ACK红细胞裂解缓冲液 (见溶液配方)
   
   1)

   氯化铵 (NH₄Cl)
   2)

   碳酸氢钾 (KHCO₃)
   3)

   乙二胺四乙酸 (EDTA)
9. 单细胞悬液 (见溶液配方)
   
   1)

   DMEM培养基 (Invitrogen, catalog number: C11965500CP)
   2)

   胎牛血清 (FBS) (Bioind, catalog number: 04-001-1ACS)
   3)

   氨苄西林钠
   4)

   硫酸链霉素

二、富集CD4⁺ T细胞相关试剂与耗材

1. EasysepTM磁铁 (Stem Cell, catalog number: 18000)
2. Anti-CD8α mAb (克隆号：2.43，BioXcell, catalog number: BE0061)
3. BioMag goat anti-Rat IgG beads (Qiagen, catalog number: 310107)
4. BioMag goat anti-mouse IgG beads (Qiagen, catalog number: 310007)
5. 1x PBS缓冲液 (见溶液配方)
   
   1)

   氯化钠 (NaCl)
   2)

   磷酸氢二钠 (Na₂HPO₄)
   3)

   磷酸二氢钠 (NaH₂PO₄)
   
   4)

   氯化钾 (KCl)
6. 1x FACS缓冲液 (见溶液配方)
   
   1)

   牛血清白蛋白 (BSA)
   2)

   叠氮钠 (NaN₃)

三、细胞分选相关试剂及耗材

1. 5 ml流式管 (康宁, catalog number: 352054)
2. CD4-PercP-Cy5.5 (克隆号：RM-5，eBioscience, catalog number: 45-0042-82)
3. CD62L-APC (克隆号：MEL-14，Biolegend, catalog number: 104412)
   

四、Treg细胞培养相关试剂及耗材

1. 96孔U底细胞培养板 (康宁, catalog number: 3799)
2. Dynabeads Mouse T-Activator CD3/CD28 for T Cell Expansion and Activation (Life Technology, catalog number: 11456D)
3. 重组人IL-2细胞因子 (简称rIL-2，PeproTech, catalog number: AF-200-02)
4. ICOS-APC (克隆号：7E.19G9，eBioscience, catalog number: 17-9942-82)
5. CellTrace Violet增殖试剂盒 (Invitrogen, catalog number: C34557)
6. Anti-mouse CD3 (克隆号：145-2C11，BioXcell, catalog number: BE0001-1)
7. 1640 RPMI完全培养基 (见溶液配方)
   
   1)

   1640 RPMI培养基 (Invitrogen, catalog number: C22400500CP)
   2)

   胎牛血清 (FBS) (Bioind, catalog number: 04-001-1ACS)
   3)

   100x NEAA (Gibco, catalog number: 11140-050)
   4)

   氨苄西林钠
   5)

   硫酸链霉素
8. 流式荧光抗体 (见溶液配方)
   

仪器设备

1. 血球计数板以及盖玻片 (国产)
2. 玻璃组织研磨片、金属筛网、研磨棒 (均为国产)
3. 30~300 μl移液枪 (BRAND)
4. 台式小型高速离心机 (Thermo Fisher Scientific, catalog number: 75002430)
5. 大型柜式离心机 (Kubota, catalog number: 5930)
6. 立式压力蒸汽灭菌锅 (博讯)
7. BD LSRFortessa 流式细胞分析仪 (5激光) (BD Bioscience, model: LSRFortessa)
8. BD FACSAria III流式细胞分选仪 (BD Biosciences，FACSArial III)
9. 旋转孵育器 (Kylin-Bell lab, model: QB-128)
10. 二氧化碳细胞培养箱 (New Brunswick Scientific, model: Galaxy 170S)
11. 生物显微镜 (重庆奥特光学仪器有限责任公司, model: B204LED)
    

实验步骤

一、小鼠淋巴结及脾脏中淋巴细胞的获取

1. 用颈椎脱臼法迅速处死小鼠，用75%酒精喷洒体表消毒，剪开腹部以及四肢皮肤和腹膜。
2. 分别取出小鼠四肢、腋下以及头颈部淋巴结、脾脏器官置于含有2% FBS的DMEM培养基中。
3. 使用磨砂面玻璃片研磨淋巴结以释放出淋巴细胞，将研磨液移至15 ml离心管中。
4. 使用研磨棒和金属筛网研磨脾脏，释放出脾脏组织中细胞，随后将研磨液移至15 ml离心管中。
5. 将淋巴结、脾脏细胞研磨液以840 x g在4 °C离心2分钟，离心后弃上清。
6. 加入1 ml ACK红细胞裂解缓冲液 (提前放置于室温环境)重悬脾脏细胞沉淀，轻轻吹打混匀，室温裂解1~2分钟，840 x g，4 °C离心2分钟，用含2% FBS的DMEM重悬细胞。
7. 将淋巴结研磨液以及裂解过红细胞的脾脏细胞以4 °C，840 x g离心2分钟。
8. 用2 ml含2% FBS的DMEM重悬细胞，用200目尼龙膜过滤，除去细胞碎片以及其他组织。 
9. 计数，确定每个样本总的淋巴细胞数以便于后期的富集、分选、培养、染色。
   

二、CD4⁺ T细胞的富集

1. 按照上述实验步骤一所示方法首先获取外周淋巴结、脾脏组织中单细胞悬液，计数，并将细胞浓度稀释至3 x 10⁷/ml。
2. 按照每3 x 10⁷个淋巴细胞加入1 μg anti-CD8α mAb，4 °C于旋转孵育器旋转孵育30分钟至1小时。
3. 补一定量的2% FBS DMEM培养基至15 ml，4 °C 2,000 x g离心2分钟去除上清，以洗去未结合的抗体。
4. 重复步骤 3。
5. 按照每3 x 10⁷个淋巴细胞各加入1 ml Goat Anti-Mouse IgG和Goat Anti-Rat IgG磁珠，根据细胞数量加入所需这两种抗体磁珠的量。然后与细胞混合均匀，4 °C于旋转孵育器旋转孵育30分钟至1小时。
   注：实验所用的抗体磁珠需要预先用Qiagen beads清洗缓冲液洗两次 (借助于EasysepTM磁铁)，并用缓冲液重悬磁珠。
6. 使用EasysepTM磁铁吸附上述孵育抗体磁珠的单细胞悬液，吸附~2分钟后 (抗体磁珠可以吸附CD8⁺ T细胞和B细胞，上清液中~90%淋巴细胞为CD4⁺ T细胞)，吸取吸附后的淋巴细胞悬液至新的15 ml离心管中，计数并根据实验需求进行后续操作如流式分选或直接培养。
   注：所有操作过程都要在无菌环境下进行，并且整个实验过程中所使用的相关试剂、耗材都要保证无菌。
   

三、分选Treg细胞

按照上述步骤二方法所示，富集得到CD4⁺ T细胞，CD4⁺ T细胞的纯度大约为90%，混合外周淋巴结和脾脏细胞每只6~8周龄大小的小鼠大约可以富集得到2 x 10⁷个CD4⁺ T细胞，如果要得到Treg细胞需要进一步进行流式分选。

1. 取富集得到的CD4⁺ T细胞，4 °C，840 x g离心2分钟，去掉上清。
2. 按照每只小鼠用300 μl含有一定比例表面荧光抗体CD4-Percp-Cy5.5, CD62L-APC,于4 °C避光孵育30分钟以上 (为了让细胞更好的接触抗体，染色期间注意弹管壁混合)。
3. 加入5 ml无菌FACS缓冲液以终止染色反应，随后用大约共1 ml等比例的FACS缓冲液和Qiagen beads清洗缓冲液重悬细胞，用无菌200目白色尼龙网 (剪成合适的大小高压灭菌即可) 过滤至无菌的流式分选管中。
4. 运用BD FACSAria III流式细胞分选仪分选CD4⁺GFP⁺CD62L^hi的细胞至含有20% FBS的1x PBS缓冲液中即为静息状态的Treg细胞。
   注：所有操作过程都要在无菌环境下进行，并且整个实验过程中所使用的相关试剂、耗材都要保证无菌。

四、Treg细胞的体外增殖培养

1. 向分选得到的Treg细胞悬液中加入5 ml 1x PBS缓冲液，4 °C，300 x g，离心8分钟，小心缓慢的弃掉上清，并用1x PBS缓冲液重悬细胞，计数备用。
2. 用CellTrace Violet试剂盒按照相关操作步骤对细胞进行标记，随后用1640 RPMI 完全培养基重悬细胞，计数，并将细胞浓度调整至0.5 x 10⁶个/ml，随后加入rhIL2至最终浓度为2,000 U/ml。
3. 根据细胞数目取出适当量的混合均匀后的Dynabeads Mouse T-Activator CD3/CD28 for T cell Expansion and Activation试剂至上述细胞浓度为0.5 x 10⁶个/ml细胞悬液中。按照每1 x 10⁶个Treg细胞需要50 μl Dynabeads (Treg细胞与Dynabeads的数目比例为1:2) 的量加入相应的DynaBeads体积至1640 RPMI完全培养基中。
   注：Dynabeads需要提前使用上述步骤中所提及的Qiagen beads清洗缓冲液清洗两次，然后再与细胞混合。
4. 取200 μl上述Treg细胞至96孔U底细胞培养板中 (培养细胞浓度为1 x 10⁵个/孔，rhIL2终浓度为2,000 U/ml)。
   注：如果培养Treg细胞使用96孔平底细胞培养板，需要保证培养细胞浓度为2 x 10⁵个/孔，如果细胞浓度太低会阻碍Treg细胞与Dynabeads的聚拢，会致使Treg细胞活化与增殖受到阻碍。
5. 37 °C，5% CO₂条件下培养5~6天。每天观察，大概24~48小时可以在显微镜下观察到Treg细胞与Dynabeads聚集到96孔U形底培养板的底部，3~6天可以看出明显的Treg细胞的活化与增殖，期间如果培养基变黄，则需要吸走一部分培养基然后补加含有rhIL2 (2,000 U/ml)的新鲜1640 RPMI培养基。
6. 根据实验需要，体外培养3~6天，收集Treg进行流式检测其增殖活化情况。
   

五、Treg细胞体外抑制试验

1. 从6~8周龄大小的C57/BL6野生型小鼠中取出外周淋巴结四肢、头颈部，得到单细胞悬液，用CellTrace Violet试剂盒按照相关操作步骤对该淋巴细胞进行标记，随后用1640 RPMI 完全培养基重悬细胞，计数，并将细胞浓度调整至1 x 10⁶个/ml。
2. 从Foxp3-GFP KI小鼠中分选得到Treg细胞，计数，用1640 RPMI完全培养基重悬细胞，并调整Treg细胞浓度至1 x 10⁶个/ml。
3. 用排枪向96孔U形底培养板的第1~11列孔中分别加入50 μl RPMI 1640完全培养基。
4. 用排枪向96孔U形底培养板的第12列孔中加入100 μl浓度为1 x 10⁶个/ml的Treg细胞。
5. 用排枪从96孔U形底培养板的第12列孔中吸取50 μl Treg细胞至第11列孔中，相对于第12列孔Treg细胞的浓度而言，此操作使得Treg细胞浓度稀释2倍。
6. 按照上述步骤5，用排枪依次从96U形底培养板的第11列孔将Treg细胞依次进行稀释至第7列孔的32倍之后，在第6列孔留下不含Treg细胞的孔。
7. 用排枪向每个孔 (第12列至第6列) 中加入50 μl步骤1中用CellTrace Violet标记的外周淋巴结细胞。
8. 用排枪向每个孔 (第12列至第6列) 加入100 μl含有anti-mouse CD3 (2 μg/ml)的1640 RPMI完全培养基。
9. 37 °C，5% CO₂条件下培养72小时，收取细胞并进行流式检测。
   具体操作实验流程见图1。
   
   
   图1. Treg细胞体外抑制实验流程图
   

结果与分析

1. Treg细胞体外增殖活化分析，见图2。
   
   
   图2. 体外Treg细胞的增殖与活化结果分析
   
   图2A显示的是根据细胞大小和相对复杂程度圈出需要分析的细胞。图2B显示的是根据CD4和GFP的表达情况，圈出Treg细胞 (CD4⁺GFP⁺) 进行后续C和D的分析。图2C中是分析Treg细胞 (CD4⁺GFP⁺) 体外培养条件下其细胞增殖和活化相关分子ICOS表达的情况。图2D是分析Treg细胞 (CD4⁺GFP⁺) 的增殖情况。以上结果显示了在体外活化条件下培养使用CellTrace Violet标记的Treg细胞的增殖与活化情况。从以上结果可以看出体外培养条件下Treg细胞会增殖并上调活化相关分子ICOS的表达。
   注：实验人员可以根据自己的实验目的与需求决定Treg细胞的培养时间。
2. Treg细胞体外抑制试验分析，见图3。
   
   
   图3. Treg细胞体外抑制功能结果分析
   
   以上结果显示，Treg细胞与T responder不同细胞浓度比例条件下，Treg细胞对CD4⁺ T细胞增殖能力的抑制情况。另外以上结果显示随着Treg细胞相对于T responder细胞浓度的降低，对CD4⁺ T细胞的抑制能力明显降低 (即CD4⁺ T细胞的增殖能力更强)。
   

失败经验

1. 本实验设计Treg细胞的分选，请注意分选速度，若分选速度过快，容易造成细胞状态损伤以及细胞死亡。另一方面还要保证Treg细胞的分选纯度，否则在培养的后期会发现有很多其他细胞亚群的增殖，进而影响Treg细胞的增殖以及结果分析的可信度。
2. Treg细胞培养密度，根据实验过程中所使用的96孔的板底来决定培养细胞的浓度，96孔U型底培养板 (1 x 10⁵个/孔)，96孔平底培养板 (2 x 10⁵个/孔)。
3. Treg细胞体外抑制试验中，要注意T responder细胞的来源，否则不能检测出Treg细胞对T细胞的增殖抑制的能力。
   

溶液配方

1. 1x ACK红细胞裂解缓冲液
   15.5 mM氯化铵 (NH₄Cl)
   1 mM碳酸氢钾 (KHCO₃)
   0.01 mM乙二胺四乙酸 (EDTA)
   pH = 7.2~7.4
   0.22 μm无菌滤膜过滤
   4 °C保存
2. 1x PBS缓冲液
   136 mM氯化钠 (NaCl)
   8.2 mM磷酸氢二钠 (Na₂HPO₄)
   1.5 mM磷酸二氢钠 (NaH₂PO₄)
   2.7 mM氯化钾 (KCl)
   pH = 7.2~7.4
   4 °C保存
3. 1x FACS缓冲液
   1x PBS缓冲液中加入
   0.2%牛血清白蛋白 (BSA)
   0.01%叠氮钠 (NaN₃)
   4 °C保存
4. 单细胞悬液 (500 ml为例)
   500 ml DMEM
   10 ml胎牛血清 (FBS)
   250 μl氨苄西林钠 (0.25 g/ml)
   250 μl硫酸链霉素 (0.25 g/ml)
5. 1640 RPMI完全培养基 (500 ml为例)
   500 ml 1640 RPMI
   50 ml胎牛血清 (FBS)
   250 μl氨苄西林钠 (0.25 g/ml)
   250 μl硫酸链霉素 (0.25 g/ml)
   5 ml 100x NEAA
   250 μl β-巯基乙醇 (预先用1x PBS缓冲液将β-巯基乙醇原液稀释250倍)
6. 流式荧光抗体
   每100 μl体系应该加入抗体的量
   0.5 μl CD4-PercP-Cy5.5 (0.2 mg/ml)
   0.5 μl CD62L-APC (0.2 mg/ml)
   0.5 μl ICOS-APC (0.2 mg/ml)
   

致谢

此实验方案主要基于周旭宇研究员之前的研究工作以及其实验室最近发表的文章 (Zhou等，2009；Wei等，2017；Zhang等，2017；Zhu等，2019)。在此致谢魏训东博士、张伟博士、张忠美博士对本实验方案的贡献。感谢张福萍研究员提供Foxp3-GFP-KI小鼠。本项工作得到了国家自然科学基金项目 (项目编号：31470882，31870911)和国家科技重大专项的资助 (项目编号：2016ZX10004222-007)。

参考文献

1. Li, M. O. and Rudensky, A. Y. (2016). T cell receptor signalling in the control of regulatory T cell differentiation and function. Nat Rev Immunol 16(4): 220-233.
2. Sakaguchi, S. (2004). Naturally arising CD4+ regulatory T cells for immunologic self-tolerance and negative control of immune responses. Annu Rev Immunol 22: 531-562.
3. Wei, X., Zhang, J., Gu, Q., Huang, M., Zhang, W., Guo, J. and Zhou, X. (2017). Reciprocal expression of IL-35 and IL-10 defines two distinct effector Treg subsets that are required for maintenance of immune tolerance. Cell Rep 21(7): 1853-1869
4. Zhang, Z., Zhang, W., Guo, J., Gu, Q., Zhu, X. and Zhou, X. (2017). Activation and functional specialization of regulatory T cells lead to the generation of Foxp3 instability. J Immunol 198(7): 2612-2625.
5. Zhou, X., Bailey-Bucktrout, S. L., Jeker, L. T., Penaranda, C., Martinez-Llordella, M., Ashby, M., Nakayama, M., Rosenthal, W. and Bluestone, J. A. (2009). Instability of the transcription factor Foxp3 leads to the generation of pathogenic memory T cells in vivo. Nat Immunol 10(9): 1000-1007.
6. Zhu, X., Zhang, W., Guo, J., Zhang, X., Li, L., Wang, T., Yan, J., Zhang, F., Hou, B., Gao, N., Gao, G. F. and Zhou, X. (2019). Noc4L-Mediated ribosome biogenesis controls activation of regulatory and conventional T cells. Cell Rep 27(4): 1205-1220 e1204.