Triglyceride Assay Kit GPO-PAP Method (Lyophilized Powder)

材料与试剂

1. 移液枪头
2. 1.5 ml EP管
3. (可选) 过滤灭菌器
4. 96孔板
5. 果蝇样本
6. 液氮
7. NaCl
8. KCl
9. Na₂HPO₄
10. KH₂PO₄
11. 甘油三酯测定试剂盒 (GPO-PAP法) (中生北控)
12. Tween-20 (阿拉丁, catalog number: T104863-100ml)
13. BSA (阿拉丁, catalog number: A104912-100g)
14. Brandford Reagent (Sigma, catalog number: B6916-500ML)
15. 1× PBS缓冲液 (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 移液枪
2. 酶标仪
3. 研磨器 (Koktes)
4. -80 °C冰箱 (Haier)
5. 离心机 (Eppendorf, model: 5415R)
6. Block Heater (Qilin Beier GL-150B)
7. 高压蒸汽灭菌锅

实验步骤

1. 样品准备：无论幼虫还是成虫，均以雌雄分开的方式收集样品 (组织样品需解剖，可以不分雌雄)。每组3个重复，每个重复5~10只。放入1.5 ml EP管后立即放入液氮，速冻后从液氮中取出管子，加入200 μl PBST (PBS + 0.05% Tween-20)，将样品用研磨器研磨，可保存在-80 °C。
2. 正式开始测定实验之前，预冷4 °C离心机，将干粉溶于10 ml反应溶液。将-80 °C冻存样品取出，瞬离样品溶液 (时间不宜长，否则使样品溶液不均匀，影响测定结果)，然后置于冰上。
3. 将上述溶液取出100 μl上清到另一1.5 ml EP管 (待测TAG，剩下100 μl用于测定蛋白) 置于冰上。
4. 用于测定TAG的100 μl样品溶液置于70 °C反应10 min。热浴后的样品可重新置于-80 °C保存。
5. 将热浴后的样品溶液取出10 μl与200 μl反应溶液。在标准曲线上取4个点，分别是0、0.0125、0.25、2.0 (mg)，各取10 μl于反应溶液。将样品与标准曲线的混合液同时置于37 °C, 30 min后取出放室温。
6. 将反应后的溶液室温12,000 × g, 2 min离心。移取离心后的反应溶液各190 μl于96孔酶标板中，记录样品位置待酶标仪测定 (Read Plate 540 nm)。
7. 用于测蛋白的100 μl样品溶液4 °C，12,000 × g离心2 min。取10 μl上清于200 μl Brandford Reagent反应溶液中。配制蛋白标准样：0、0.0125、0.25、0.5、1、2 mg/ml BSA溶液，各取10 μl标准曲线溶液于200 μl Brandford Reagent反应溶液中，37 °C反应10 min，后取出放室温。取180 μl置于96孔板中，酶标仪测定蛋白浓度 (Read Plate 595 nm)。
   

溶液配方

1. 1× PBS缓冲液
   磷酸缓冲盐缓冲液 (PBS)
   137 mmol/L NaCl
   2.7 mmol/L KCl
   10 mmol/L Na₂HPO₄
   2 mmol/L KH₂PO₄
   用800 ml蒸馏水溶解8 g NaCl，0.2 g KCl, 1.44 g Na₂PHO₄和0.24 g KH₂PO₄。用HCl调节溶液的pH值至7.4，加水至1 L。分装后在15 psi (1.05 kg/cm²) 高压蒸汽灭菌20 min，或通过过滤除菌，保存至室温
   

参考文献

1. Liu, Y., Wang, W., Shui, G. and Huang, X. (2014). CDP-diacylglycerol synthetase coordinates cell growth and fat storage through phosphatidylinositol metabolism and the insulin pathway. PLoS Genet 10(3): e1004172.