Ca-phosphate-mediated Transient Transfection method in Drosophila S2 Cells

材料与试剂

1. 6孔细胞培养板 (Thermo Fisher Scientific, Nunc, catalog number: 140675)
2. 24孔细胞培养板 (Thermo Fisher Scientific, Nunc, catalog number: 142475)
3. 1.5 ml塑料离心管 (Corning, AXYGEN, catalog number: MCT-150-C)
4. 果蝇S2细胞
5. 一次性无菌过滤装置 (Thermo Fisher Scientific, Nelgene, catalog number: 1660045)
6. CaCl₂ (Merck, Sigma-Aldrich, catalog number: 223506)
7. NaCl (Merck, Sigma-Aldrich, catalog number: S5886)
8. KCl (Merck, Sigma-Aldrich, catalog number: P9333)
9. Na₂HPO₄ (Merck, Sigma-Aldrich, catalog number: S7907)
10. Glucose (Thermo Fisher Scientific, Gibco, catalog number: 15023021)
11. HEPES (free acid) (VWR Life Science, AMRESCO, catalog number: 0511)
12. NaOH (Merck, Sigma-Aldrich, catalog number: 221465)
13. 0.25 M CaCl₂ (见溶液配方)
14. 2× HEPES (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 震荡混匀仪 (Vortex) (其林贝尔, model: VORTEX-5)

实验步骤

1. 待细胞生长密度达到90%左右时，传代至6孔板，每孔约2 ml培养基，至少两小时后，当细胞密度达到40%左右时可进行转染 (图1)。
   
   
   图1. S2细胞生长密度达到90% (左) 和40% (右)
   
   
2. 取1.5 ml离心管，将3 μg左右的质粒或RNA稀释在100 μl 0.25 M CaCl₂中。
3. 取1.5 ml离心管加入100 μl 2× HEPES，将CaCl₂/DNA混合物逐滴加入，边加边用震荡混匀仪混匀。(也可以边加边用手指弹匀)
4. 将混合物静置10~20分钟，然后逐滴加入到细胞中，轻轻摇晃细胞培养板将其混匀。
5. 约12小时后，为细胞更换新鲜的培养基。
6. 对于24孔板，可使用约35 μl左右的CaCl₂和2× HEPES，其他培养皿可酌情增减。
   

注意事项

1. 磷酸钙转染需使用含血清的培养基，对于无血清培养基培养的细胞，磷酸钙转染效率极差。
2. CaCl₂和2× HEPES配制后需分装保存，转染时若两者混合后产生沉淀，则说明溶液的pH异常，需重新调节或配制。
   

溶液配方

1. 0.25 M CaCl₂
   过滤，分装后-20 °C保存
   
2. 2× HEPES (500 ml)
   8.00 g NaCl
   0.35 g KCl
   0.20 g Na₂HPO₄
   1.00 g Glucose
   5.00 g HEPES
   加双蒸水至500 ml，之后用1 ml左右10 N NaOH调节pH至7.10。过滤，分装后-20 °C保存
   

致谢

本实验室的工作得到细胞增殖与分化重点教育部重点实验室、膜生物学国家重点实验室、生命科学联合中心、国家自然科学基金和科学技术部的资金支持。本实验方案改编自本实验室的发表文章Du等 (2016) 和 Liu等 (2016)。

参考文献

1. Du, J., Zhang, J., He, T., Li, Y., Su, Y., Tie, F., Liu, M., Harte, P. J. and Zhu, A. J. (2016). Stuxnet facilitates the degradation of polycomb protein during development. Dev Cell 37(6): 507-519.
2. Liu, M., Li, Y., Liu, A., Li, R., Su, Y., Du, J., Li, C. and Zhu, A. J. (2016). The exon junction complex regulates the splicing of cell polarity gene dlg1 to control Wingless signaling in development. Elife 5: e17200.