Preparation of Drosophila Total RNA

材料与试剂

1. 1.5 ml离心管
2. 果蝇
3. TRIzol^TM Reagent (Invitrogen^TM, catalog number: 15596026)
4. TURBO DNA-free^TM Kit (Invitrogen^TM, catalog number: AM1907)
5. 异丙醇
6. 乙醇
7. DEPC-H₂O
   

仪器设备

1. 离心机 (Eppendorf)
2. Thermomixer compact (Eppendorf)
   

实验步骤

注：该实验需要在RNA洁净区操作，RNA易降解，需要使用RNA专用试剂耗材和设备。务必佩戴洁净的手套甚至口罩。

1. 取200 μl TRIzol置于1.5 ml离心管中，放在冰上，将麻醉的10只果蝇放入冰上的离心管中，将果蝇碾碎，再加入800 μl TRIzol试剂，颠倒混匀。
2. 室温放置10 min，间歇混匀数次。
3. 4 °C，12,000 × g离心10 min，去掉果蝇残体，取上清至新管。
4. 加入200 μl氯仿，混匀，室温放置5 min。
5. 4 °C，12,000 × g离心15 min。
6. 取上清 (约500 μl) 到新的RNAase free的离心管中，加入等体积的异丙醇混匀，室温放置10 min。
7. 4 °C，12,000 × g离心30 min。
8. 弃上清，加入500 μl 70%乙醇，颠倒数次，使RNA漂浮。
9. 4 °C，7,500 × g离心5 min。
10. 弃乙醇，如果残留的乙醇有挂壁现象，倒掉液体后再短暂离心，将残液用移液器吸出。室温放置直到白色沉淀呈透明装时加入50 μl DEPC-H₂O溶解。
11. 50 °C，600 rpm金属浴震荡混匀10 min或者时不时轻弹混匀。
12. 加入1 μl DNase，5 μl DNase Buffer，37 °C温育30 min。
13. 加5 μl DNase inactive reagent，室温放置5 min，间歇混匀2~3次。
14. 4 °C，10,000 × g离心1.5 min。
15. 转移上清至新的EP管中，测浓度；-80 °C保存。