Drosophila Genomic DNA Preparation

材料与试剂

1. 1.5 ml离心管
2. 动物基因组DNA抽提试剂盒 (生工生物工程(上海)有限公司, catalog number: B518221)
3. 氯仿
4. 异丙醇
5. 乙醇
6. Tris
7. HCl
8. EDTA
9. RNase A (10 mg/ml)
10. TE buffer (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 移液器
2. 水浴锅 (上海精宏实验设备有限公司, model: XMTE-8112)
3. 小型高速离心机 (Eppendorf)
4. 一次性组织研磨杵(生工生物工程(上海)有限公司, catalog number: F619071)
   

实验步骤

注：提前将水浴锅调至65 °C备用。Buffer Digestion在低温下可能产生沉淀，使用前请检查，如有沉淀，请于65 °C溶解后使用。

1. 取20~25只果蝇，加入到1.5 ml离心管中，加入400 μl Buffer Digestion，用研磨棒研碎，震荡混匀。65 °C水浴1 h至完全裂解。
   
   1.1

   通常动物组织完全裂解需要1~3小时，取样过多会影响提取DNA的质量。
   1.2

   水浴过程中，每10 min颠倒混匀一次，可促进样品裂解。混合液变澄清透明为裂解完全。如溶液未变澄清，说明细胞裂解不彻底，应适当延长水浴时间，否则将可能降低DNA的得率或导致提取的DNA不纯。
   1.3

   如需得到无RNA的DNA，可在水浴后加入20 μl的RNase A (10 mg/ml)，室温放置2~5 min。
2. 加入200 μl Buffer PA，充分颠倒混匀，置于-20 °C冰箱放置5 min。
3. 室温10,000 rpm离心5 min，将上清液 (500~550 μl) 转移到新的1.5 ml离心管中。
   注：若上清液混浊，可再加入等体积氯仿剧烈混匀，12,000 rpm离心取上清。
4. 加入等体积的异丙醇，颠倒5~8次使之充分混匀，室温放置2~3 min。室温10,000 rpm离心5 min，弃上清。
5. 加入1 ml 75%乙醇，颠倒漂洗1~3 min，10,000 rpm离心2 min，弃上清。
   注：漂洗时一定要使沉淀悬浮起来。
6. 重复一次步骤5，如果倒掉液体后残留的乙醇有挂壁现象，则再短暂离心，将残液用移液器吸出。
7. 开盖室温倒置5~10 min至残留的乙醇完全挥发。
   注：
   
   1)

   此步绝不可省略，否则残留的乙醇会严重影响后续实验。
   2)

   过度干燥将导致DNA重新溶解困难，肉眼可见DNA沉淀变成半透明状，离心管无明显乙醇味道即可，避免使用真空干燥器进行干燥。
8. 得到的DNA用100~200 μl TE Buffer溶解。提取的DNA可立即进行下一步实验或-20 °C保存。
   注：25只果蝇成虫个体能得到约200 μg的DNA。
   

溶液配方

1. TE buffer (pH 8.0)
   10 mM Tris-HCl
   1 mM EDTA