Preparation of Ultrathin Section and Observation of Strawberry Sub-cellar Structure by Transmission Electron Microscopy

材料与试剂

1. 剪刀
2. 牙签
3. 离心管 (1.5 ml，10 ml，50 ml)
4. 1 ml注射器
5. 包埋板
6. 硫酸纸 (称量用纸)
7. 铅笔
8. 双面刀片
9. 25 mm的玻璃条
10. 夹头
11. 叉子
12. 胶布
13. 石蜡
14. 载玻片
15. 滤纸
16. 培养皿
17. 吸管
18. 锡箔纸
19. 封口膜
20. 草莓果肉、叶片
21. 板栗叶片、花粉
22. 戊二醛
23. 0.1 M酸缓冲液
24. 多聚甲醛
25. 锇酸 (OsO4) (中兴百瑞)
26. 纯酒精
27. 重蒸水
28. 丙酮
29. 包埋剂
30. 氯仿
31. 醋酸铀染液 (中兴百瑞)
32. NaOH颗粒
33. 柠檬酸铅 (中兴百瑞)
34. Spurr树脂套装：ERL-4221、DER-736、NSA、DMAE (中兴百瑞，catalog number: ZB-S0070)
35. Na₂HPO₄•12H₂O
36. NaH₂PO₄•2H₂O
37. Spurr树脂(偏硬性) (见溶液配方)
38. 2.5 %戊二醛固定液 (见溶液配方)
    1)

    0.2 M磷酸氢二钠
    2)

    0.2 M磷酸二氢钠 
    3)

    0.2 M磷酸缓冲液
39. 锇酸固定液 (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 镀膜铜网 (中兴百瑞)
2. 胶条 (制水槽) (中兴百瑞)
3. 通风橱
4. 烘箱
5. 修块机 (Leica)
6. 制刀机 (Leica)
7. 切片机 (Leica)
8. 捞样器 (中兴百瑞)
9. 干燥器
10. 透射电镜
    

实验步骤

1. 植物样品固定
   草莓果肉：草莓对切，选择果皮附近的果肉，切成1 mm³的小块儿，用牙签轻轻地把材料拨到盛有2.5%戊二醛固定液的1.5 ml离心管中。
   叶片：叶肉细胞的部位，剪成数块1 mm²的小块，然后用牙签轻轻地把材料拨到盛有2.5%戊二醛固定液的1.5 ml离心管中。抽真空30 min，真空固定1.5-2 h，使材料尽快沉入固定液中。放于4 °C隔夜固定。
   注：若长期保存，可隔段时间换次固定液，于4 °C保存。
2. 冲洗
   在2.5 %戊二醛固定之后，植物样品用0.1 M，pH 7.2的磷酸缓冲液 (见溶液配方) 冲洗。冲洗10次，每次10 min。弃掉冲洗液。
3. 锇酸固定
   在通风橱中，快速将2%锇酸与0.2 M PBS (体积比为1:1)加入1.5 ml离心管，直至没过样品，并立刻盖好盖。轻轻晃动样品，使样品固定充分。果肉固定2 h，叶片固定1-1.5 h (叶片易脆，不易固定时间过长)，直至样品变为黑色 (如图1)，其间晃动一次。
   注：因为OsO₄极易挥发，剧毒，其蒸气对皮肤、粘膜、角膜均有固定作用，务必注意安全，在通风橱中规范操作。
   
   
   图1. 锇酸固定后样品状态
   
   
4. 冲洗
   冲洗植物样品用0.1 M，pH7.2的磷酸缓冲液冲洗。冲洗10次，每次10 min。弃掉冲洗液。
5. 脱水
   将样品用牙签小心地转移到新的离心管中，用刻度10 ml离心管、纯酒精和重蒸水配成10 %、30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%、100 %的系列乙醇溶液。
   按上述梯度的酒精溶液对样品逐级进行脱水，每级15 min，室温进行。
6. 置换
   梯度脱水后，用丙酮置换三次，每次30 min，室温进行。
   注：用纯酒精脱水和丙酮置换时，将前一级倒出，要马上倒入下一级，以防材料干燥。
7. 浸透
   丙酮:包埋剂=1:1；1:2；1:3，用10 ml离心管混匀，梯度浸透，每梯度浸透8 h，室温进行。
8. 包埋
   首先小心地用1 ml注射器把包埋剂注射在干燥的包埋板孔中，约2/3。用牙签小心地把样品挑到孔的两头 (要切的那一面靠外)。在2 × 4 (mm²) 的硫酸纸上用铅笔写标签：简要注明样品名称及组织块号数，把标签摆在包埋板孔中。最后用包埋剂将孔充分的灌满 (因为在聚合后体积会缩小)。
9. 聚合
   样品包埋完后，放入60 °C烘箱进行聚合12天以上 (标准：指甲抠着不掉渣，即可试着修块切片) (如图2)。
10. 修组织块
    包埋块聚合好后就可修组织块。修块的目的是为了暴露样品及修平切面，以便连续切片。
    
    1)

    将包埋块夹在样品夹头上，用修块机把包埋块的样品处修成四面锥体。
    2)

    在解剖镜下，用双面刀片把包埋块顶部修成光滑的平面。这个平面要求暴露组织，0.1-0.2 mm的梯形 (如图2)。
    
    
    图2. 包埋聚合后样品块状态及修块后状态
    
    
11. 制刀
    
    1)

    将导板放在90°角线上，松开锁紧螺旋钮。
    2)

    将特制25 mm的玻璃条靠在导板上，并将玻璃条向左推，直顶到阻止螺栓。
    3)

    将玻璃固定器固定在刚触到玻璃条的位置并用锁紧螺拴锁住。
    4)

    扳下夹头，直到接触到玻璃条为止。
    5)

    划线：将玻璃划割器拉出，到头。
    6)

    断裂：顺时转动断裂旋钮，一直到玻璃断裂为止，之后将断裂旋钮转回原位。
    7)

    托起夹头，退回玻璃划割器，用叉子将玻璃方块取出。
    8)

    将调节盘转动5个格的角度,以使划线略微偏离对角线。
    9)

    将方块玻璃对角放在固定器处。按：11.3、11.4、11.6、11.7的步骤，重调固定器位置、划线、断裂；最后取出玻璃刀并将仪器复原。
    注：制刀前，需把玻璃用肥皂洗净、烘干，以供使用；制刀过程，要随时用小毛刷对仪器面清扫，确保无玻璃碎渣及其它脏东西，否则将造成断裂玻璃时，各部位用力不协调，损伤刀口使仪器性能下降。
12. 制作水槽
    制作水槽以使超薄切片漂浮在水面上。
    
    1)

    用宽约6 mm、长约30 m的胶布，将刀刃封围起来。
    2)

    用石蜡浸封 (防止漏水) (如图3)。
    注：胶布槽的上沿，要与玻璃刀刃平行。否则，很难连续切片。
    
    
    图3. 合格水槽与不合格水槽
    
    
13. 半薄切片和超薄切片
    
    1)

    安装包埋块，将修整好的包埋块夹在样品夹中，顶端露出约2 mm。在样品臂静止的情况下，将样品夹头固定在样品臂的定向头中，固定时，使切面与刀刃平行。
    2)

    将切片刀紧夹在刀架中，并使刀刃与待切片面上线等高。
    3)

    通过调节刀的旋转和平移旋钮，使可供切片的刀刃部位对准和平行于组织切面。
    4)

    抬高样品臂，使样品离开刀刃。用注射器向水槽中滴加蒸馏水，直到液面浸没刀刃。并使液面上形成一白色亮区。
    5)

    对好刀后，按下绿色“RUN/Stop”钮，使切片机进入自动切割状态。
    6)

    根据切片颜色等状况，调节切片速度和厚度。
    半薄切片通常为2 m/s 500 nm；超薄切片通常为2 m/s 50 nm。切片颜色以银白到浅黄色为宜，并以连续切片成带为好 (如图4)。习惯而言，可以先切半薄，然后将样品块儿修的更小些，切超薄。
    
    
    图4. 超薄切片状态
    
    
    7)

    捞片
    半薄切片：将捞样器伸入水下，捞起样品形成一个水膜，则捞样成功。然后将样品倒扣在滴有水滴的载玻片上。
    超薄切片：切出足够的片子后，关上自动切片，用眉毛针轻轻地将切片集中在一起。如果切片发皱，可用蘸有氯仿的滤纸，在切片上方熏蒸切片，使其展平。然后用尖镊子夹住带膜铜网的边缘，膜朝下，水平地对准切片向下轻轻一沾，再水平地提起，即把切片捞起。将铜网放在画好分格的培养皿里 (培养皿中放滤纸，固定好，画好分格，做好标记，按标记放置铜网) (如图5)。
    
    
    图5. 镊子蘸取法捞样及样品分格摆放
    
    
14. 切片染色
    
    1)

    将煮沸的100 ml重蒸水，放入50 ml离心管中待用。
    2)

    用吸管吸取醋酸铀染液按照需要染色的铜网数目，顺序地滴在蜡盘 (即用锡箔纸包裹的培养皿中放入一个贴有封口膜的载玻片)上。
    3)

    将带切片的铜网放在醋酸铀液滴上，有膜的那面朝下，盖上盘，染色30分钟。
    4)

    用镊子将铜网取出，用滤纸稍微吸附醋酸铀，然后2 ml注射器用重蒸水冲洗数次。
    5)

    用滤纸吸掉铜网上的水份。
    6)

    另一个蜡盘中，在载玻片周围放一圈NaOH颗粒，载玻片上顺序滴加柠檬酸铅液滴。
    7)

    把铜网放在柠檬酸铅液滴上。放好后，迅速盖上盖，染色30分钟。用煮沸的重蒸水洗去多余的染色液，用滤纸吸干铜网上多余的水分。将铜网放在画好分格的培养皿里，置干燥器待观察 (如图6)。
    注：染液配制，贮存及染色过程应尽量减少与二氧化碳接触，不要直接对着染液呼吸，敞盖时间越短越好以防二氧化碳污染。
    
    
    图6. 染色方法图示
    
    
15. 透射电镜观察 (图7)
    
    
    图7. 透射电镜
    
    
    1)

    打开变压器开关，冷却器开关，两个冷却器，机械泵。
    2)

    主机的电源钥匙扳到“EVAC ON”位置。
    3)

    开机20~30分钟后，电子枪、镜体和照相室EVAC指示灯停止闪动点亮 (橘黄色)。
    4)

    钥匙开关扳到COL、ON位置；样品室排气开关是在EVAC位置。
    5)

    单击V电压按钮，点击HV ON，灯丝会自动加载；单击F灯丝，观察时为ON；单击Stage control，控制面板；单击E，即EVAC control。同时，把照相系统电脑开机，打开软件及CCD开关。
    6)

    放样品
    关闭灯丝，OFF；将样品杆拔出一半，向外拧，会有一个卡槽卡住，响一声；拌动按钮至AIR，进气；待灯灭了之后，完全拔出样品杆；换了样品铜网后，将样品杆插入一半，将按钮扳至EVAC，抽真空；待灯变绿，立刻将样品杆先向外，然后向里插，再向内拧，至样品杆完全进入样品室。
    7)

    换完样品后，将灯丝打开，ON。
    8)

    加载光圈，至看到样品，可以在高倍镜下对焦，然后将光圈调小。
    9)

    待光圈调小后，单击软件内的Camera Inserted，单击start view，观察样品，选择合适放大倍数，聚焦，拍照，采集到照片后，单击“保存123”按钮，即可保存。
    10)

    换其他视野，采集更多照片。
    11)

    换其他样品前，转换照片格式，在file选项下的Batch Convert，点击按选项，转换完成后，选择OK；在电脑桌面的文件夹里打开CCD文件夹，把里面的照片剪切出来，创建文件夹，粘贴保存。
    12)

    关机
    加速电压OFF；关闭灯丝、Stage control和EVAC control后，电脑关机，钥匙开关扳到EVAC ON的位置；
    抽真空约30分钟，钥匙开关扳到OFF位置；
    60分钟后，电镜的指示灯灭，依次关掉机械泵、冷却器和变压器。
    13)

    数据拷贝
    注：拷数据照片时，一定要格式化的优盘！

结果与分析

草莓果肉超薄切片结果如图8所示，细胞完整清晰，厚度均一。


图8. 草莓果肉超薄切片结果

溶液配方

1. Spurr树脂 (偏硬性)
   

   ERL-4221	10 g
   DER-736	5 g
   NSA	26 g
   DMAE	0.4 g

   搅拌均匀，真空抽约40 min，至无气泡，-20 °C保存。
2. 2.5 %戊二醛固定液
   1)

   配制0.2 M 磷酸氢二钠
   Na₂HPO₄•12H₂O   71.64 g，加重蒸馏水至 1,000 ml
   2)

   配制0.2 M 磷酸二氢钠
   NaH₂PO₄•2H₂O     31.21 g，加重蒸馏水至 1,000 ml
   3)

   配制0.2 M 磷酸缓冲液 
   
   
   
   4)

   配制戊二醛固定液的配制 
   
   
   
3. 锇酸固定液
   1)

   锇酸水溶液的配制
   注: 锇酸是一种淡黄色晶体，封装于安培瓶内，低温保存。使用时常常配成2-4%的水溶液做贮备液。
   先将装有锇酸的安培瓶标签撕掉，用划玻璃的砂轮在管中间划一印纹后洗干净，再用洗液浸泡，而后用重蒸馏水冲洗，放入洗净的装重蒸水的棕色玻璃瓶内，打破安培瓶，盖好盖振荡，置冰箱慢慢溶解，一般2-3天后可完全溶解为无色透明溶液
   2)

   1%锇酸固定液的配制
   取2%锇酸水溶液25 ml，0.2 M 磷酸缓冲液25 ml，混匀，置冰箱待用

致谢

感谢国家自然基金 (31370323) 的支持。