Transformation of Arabidopsis thaliana by Floral Dip

材料与试剂

1. 培养钵
2. 保鲜膜
3. 营养土 (泥炭土:蛭石:牛粪=1:1:1)
4. 带有目的基因载体的农杆菌菌株
5. 苗龄5周左右的拟南芥植株
6. 蔗糖
7. Silwet-77 (国药集团)
8. 含抗生素的LB培养基
9. VB
   

仪器设备

1. 剪刀
2. 生长室
3. 震荡培养箱
4. 台式离心机
5. 分光光度计
   

实验步骤

1. 长日照 (光照16 h、黑暗8 h) 环境下种植健壮的拟南芥植株 (约5周)。
2. 剪掉最开始抽出的1-5 cm长的初生主花序 (促进长出更多的侧生花序)。修剪后一个星期内进行渗透转化 (一般3~5 d)。并且在渗透转化的前1 d植株需充分浇水，以便植物气孔在转化时充分张开。
3. 准备农杆菌液。通常先用1 ml 含抗生素的LB培养基培养已经转化了目的表达载体的农杆菌液，然后再吸取150 μl培养过夜的菌液加入到150 ml 新鲜的液体LB培养基中28 °C环境下震荡培养24 h。
4. 4,000 x g，20 min离心菌液，然后将菌重悬于120 ml渗透液 (10%蔗糖 + 400 μl/L Silwet-77，蘸花前充分混匀，OD₆₀₀=0.8-1.0) 中。与此同时，剪掉植株上的果荚和已经完全开放的花。
5. 将植株的地上部分浸入菌液中1 min，轻微震荡。
6. 用保鲜膜将侵染过的植株罩起来以保持湿度，暗培养1 d，然后置于正常培养条件，2~3 d后可去掉保鲜膜，转化后1周左右方可浇水，并定期继续侵染几次。
7. 继续培养至植物成熟，收种子放在干燥环境中1周左右，即可筛选转化子。
   

注意事项

1. 在去除初生花序后，次生花序约2-10 cm时最适宜侵染。因为此时有许多可用来侵染的花蕾。
2. 渗透液浓度在0.15~1.74之间时，转化率没有明显变化。
3. Silwet L-77浓度在0.02%~0.1%时，转化率是0.005%时的10-20倍，故一般采用的浓度为0.05%。但是，值得注意的是利用高浓度的Silwet L-77进行侵染时，在某些环境下会导致植物组织坏死。