Construction of Binary Expression Vector Using Gateway System

材料与试剂

1. 目的基因质粒
   
2. 目的基因正反向引物
   
3. BP酶
   
4. LR酶
   
5. 入门载体 (pDONR207，庆大霉素抗性)
   
6. Gateway超量表达终载体 (pK7WG2D，壮观霉素抗性)
   
7. Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase (诺唯赞，catalog number: P505-d1)
   
8. 大肠杆菌Db3.0感受态细胞
   
9. 其它材料试剂参见“PCR扩增及克隆基因” (徐远涛和徐强, 2018)
   
10. 60%甘油 (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 低温水浴锅
   
2. 其他设备参见“PCR扩增及克隆基因” (徐远涛和徐强, 2018)
   

实验步骤

1. 目的基因Cs7g29500的克隆
   1.1

   根据基因Cs7g29500的CDS序列设计如下引物：
   attB1_Cs7g29500-ox-F: AAAAAGCAGGCTCCATGGCAATTTCAGCATTCAGAG
   attB2_Cs7g29500-ox-R: AGAAAGCTGGGTTTCATTTGAAACTGTCTCT
   Adapter attB1: GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT
   Adapter attB2: GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT
   绿色背景序列为Cs7g29500的CDS序列正反向引物，同时加了接头序列 (下划线部分序列)。克隆其它任何基因时，一般截取CDS起始密码子开始的20个碱基替换attB1_Cs7g29500-ox-F引物中的绿色背景序列，截取CDS终止密码子往前20个碱基的反向互补序列替换attB2_Cs7g29500-ox-R引物中的绿色背景序列，下划线部分序列不变。
   
   1.2

   第一轮PCR反应：

   20 μl体系：
   双蒸水	7.7 μl
   2x Phanta Max Buffer	10 μl
   dNTPs (2mM each)	0.4 μl
   attB_ Cs7g29500-ox_F	0.5 μl
   attB_ Cs7g29500-ox_R	0.5 μl
   目的基因质粒	0.5 μl
   Phanta Max酶	0.4 μl
   PCR程序：
   Step 1: 95 °C	3 min
   Step 2: 95 °C	15 s
   Step 3: 55 °C	15 s
   Step 4: 72 °C	30-60 s/kb
   Step 5: goto Step 2-4,	34个循环
   Step 6: 72 °C	5 min
   Step 7: 12 °C	30 min

   1.3

   一轮PCR反应完成后，取部分PCR产物跑胶检测用否清晰目的带。如有，则取1 μl剩余PCR产物作为模板，进行第二轮反应。
   
   1.4

   第二轮PCR反应：
   

   50 μl体系：
   双蒸水	17 μl
   2x Phanta Max Buffer	25 μl
   dNTPs (2mM each)	1 μl
   attB_ Cs7g29500-ox_F	2.5 μl
   attB_ Cs7g29500-ox_R	2.5 μl
   一轮PCR产物	1 μl
   Phanta Max酶	1 μl
   PCR程序：
   Step 1: 95 °C	3 min
   Step 2: 95 °C	15 s
   Step 3: 55 °C	15 s
   Step 4: 72 °C	30-60 s/kb
   Step 5: goto Step 2-4,	34个循环
   Step 6: 72 °C	5 min
   Step 7: 12 °C	30 min

   1.5

   50 μl反应产物全部在大孔胶上样，跑胶，切目的带回收，用Nanodrop测回收产物浓度，标记名为attB-Cs7g29500-ox以准备下步实验。
2. BP反应
   2.1

   BP反应及体系:
   
   其中，X=(质粒的大小*16.5)/质粒浓度；质粒大小用kb表示，比如Cs7g29500大小为1.6 kb，而浓度为10 ng/μl，则X=16.5*1.6/10；Y=(质粒的大小*16.5)/质粒浓度 (计算同X，但是pDONR207大小为约5.5 kb),一般质粒载体浓度调整为150 ng/μl使用。
   
   2.2

   反应液在25 °C水浴至少4 h或过夜，不需要终止反应而直接用于大肠杆菌转化，方法参照“PCR扩增及克隆基因” (徐远涛和徐强, 2018)。转化后37 °C培养过夜长出单克隆。PCR鉴定阳性后，挑单克隆菌液送测序，确认序列正确无误后扩繁提质粒用于做LR反应 (质粒名称定为pDONR207_Cs7g29500-ox)。
3. LR反应
   3.1

   LR反应及体系:
   
   其中，X=(质粒的大小*16.5)/质粒浓度；质粒大小用kb表示，比如pDONR207-Cs7g29500-ox大小约为6kb，而若质粒浓度为100 ng/μl，则X=16.5*6/100；Y=(质粒的大小*16.5)/质粒浓度 (计算同X，但是pK7WG2D大小约为13 kb)。
   
   3.2

   反应液在25 °C水浴至少4 h或过夜，不需要终止反应而直接用于大肠杆菌转化，方法参照“PCR扩增及克隆基因”。转化后37 °C培养过夜长出单克隆。PCR鉴定阳性后，挑单克隆菌液送测序，确认序列正确无误后扩繁提质粒 (质粒名称定为pK7WG2D_Cs7g29500-ox)。

注意事项

1. 常用入门载体主要有：pDONR207 (庆大霉素抗性)、pDONR201 (卡那霉素抗性)、pDONR221 (卡那霉素抗性)。载体上含有ccdB致死基因，不能通过常用Trans 5α E. coli感受态细胞来扩繁，需要用抗ccdB致死基因的感受态Db3.0来扩繁。
   
2. Gateway载体非常丰富，可以满足各种转基因需求，可以在专业网站：https://gateway.psb.ugent.be/search查询载体详细信息。
   
3. Gateway系统中载体一般都为壮观霉素和抗性，做克隆时确保使用含相应抗生素的平板。
   
4. 在BP反应后，检测单克隆阳性所用引物为目的基因引物或者attB1和attB2或者组合引物；测序所需引物为：PDONR-F: TCGCGTTAACGCTAGCATGGATCTC；PDONR-R: GTAACATCAGAGATTTTGAGACAC。此为公共引物，测序公司可以会免费提供。pDONR221载体也可用M13引物检测阳性和测序。
   
5. 在LR反应后，检测单克隆阳性所用引物为目的基因引物或者attB1和attB2或者组合引物；测序所需引物为：最好选择载体上的正向引物和基因本身的反向引物，比如：正向引物用35S，反向引物用attB2_Cs7g29500-ox-R。也可以用attB1、attB2测序。
   
6. 获得序列正确的入门载体和终载体克隆之后，质粒保存于-20 °C冰箱，同时将菌液与60%甘油等体积2:1混合，甘油终浓度为20%，-80 °C超低温冰箱保存。
   

溶液配方

1. 60%甘油
   300 ml甘油与200 ml双蒸水在500 ml蓝盖瓶中混合，121 °C、15 min灭菌，常温无菌保存备用。
   

参考文献

1. 徐远涛，徐强. (2018). PCR扩增及克隆基因. Bio-101 e1010202. Doi: 10.21769/BioProtoc.1010202.