Extraction of Total RNA from Citrus

材料与试剂

1. RNase-free 离心管 (10 ml、1.5 ml、200 μl)
   
2. RNase-free枪头 (5 ml、1 ml、200 μl、20 μl)
3. 液氮
4. 氯仿
5. 异丙醇
6. 无水乙醇
7. 异硫氰酸胍
8. 硫氰酸铵
9. 水饱和酚
10. NaAc
11. 甘油 (丙三醇)
12. 8-羟基喹啉
13. 正丁醇
14. CTAB
    
15. DEPC (焦碳酸二乙酯)
16. Tris Base
17. HCl
    
18. EDTA-Na₂
19. NaOH
20. Sarcosy
21. NaCl
22. 冰醋酸
23. 3 mol/L NaAc (pH 5.2) (见溶液配方)
24. Trizol Buffer (见溶液配方)
25. 75%乙醇 (见溶液配方)
26. TESAR (见溶液配方)
27. Aq/CTAB与Bu/CTAB (见溶液配方)
28. 0.2 mol/L NaCl (见溶液配方)
29. 3 mol/L NaAc (见溶液配方)
30. DEPC水 (见溶液配方)
31. 0.5 mol/L EDTA (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 研钵
2. -20 °C冰箱
3. 各种规格的移液器
4. 离心机 (配备10 ml、1.5 ml转头，转速大于14,000 x g)
5. 振荡涡旋仪
6. 量筒 (500 ml、100 ml)
7. pH计
8. 磁力搅拌器
9. 带盖广口瓶 (5 L)
10. 蓝盖瓶 (1 L)
11. 通风橱
12. 电泳槽
13. 制胶板
14. 凝胶成像仪
    

实验步骤

1. 粗提
   1.1

   向10 ml RNase-free离心管中加入5 ml Trizol Buffer备用。
   
   1.2

   取适量新鲜活体组织样品 (或超低温冰箱保存) 在预冷的研钵中加液氮迅速充分研磨，称取0.5 g研磨好的样品 (一般叶片加0.3 g，愈伤组织加0.5 g，果肉加0.9 g，果皮加0.6 g) 加入装有Trizol Buffer的离心管中。剧烈混匀，室温静置15 min。
   
   1.3

   每管加5 ml (2 ml) 氯仿，充分振荡混匀15-30 sec。
   
   1.4

   静置10 min后，4 °C、12,000 x g离心15 min。
   
   1.5

   吸取上清液转入新离心管，加入等体积预冷的异丙醇 (约3.5 ml)，轻轻混匀。
   
   1.6

   室温静置10 min后，4 °C、12,000 x g离心20 min。
   
   1.7

   弃上清，加5 ml预冷的75%乙醇浸泡至少30 min。
   
   1.8

   4 °C，12,000 x g轻甩5 min，弃乙醇，风干。
2. 纯度
   2.1

   向沉淀中加入800 μl TESAR，800 μl Aq/CTAB和800 μl Bu/CTAB，剧烈震荡涡旋3 min至白色沉淀完全溶解。
   2.2

   将混合液转入两个1.5 ml离心管中 (每个1.2 ml)。
   2.3

   4 °C、13,500 x g离心6 min。
   2.4

   将2个离心管中的上层清液转入同一新的1.5 ml离心管中。
   2.5

   加入350 μl 0.2 mol/L的NaCl，涡旋1 min，4 °C、13,500 x g离心5 min。
   2.6

   小心吸取下清液到新离心管，加入50 μl 3 mol/L NaAc和1 ml预冷的无水乙醇，轻轻混匀，置于-20 °C冰箱冰冻1 h。
   2.7

   4 °C、13,500 x g离心30 min，弃上清，稍风干。
   2.8

   加入60 μl DEPC水溶解RNA。
   
3. 浓度检测
   取1 μl RNA用NanoDrop1000测定230 nm、260 nm及280 nm的吸光值及RNA浓度。浓度最好控制在3,000以下，否则稀释。高质量的RNA要求：A₂₆₀/A₂₈₀ > 1.8，A₂₆₀/A₂₃₀ > 2.0，曲线平滑。
   
4. 琼脂糖凝胶电泳检测
   根据RNA浓度取700 ng RNA稀释至5 μl后，用1x TAE，1.2%琼脂糖凝胶120 V电泳20 min，凝胶成像仪拍照保存。高质量的RNA呈现三条清晰条带，点样孔干净无污染、泳道无拖带。从点样孔由近到远三条带依次为28S、18S、5S。28S、18S带很亮，5S带较弱，说明RNA完整性较好。

注意事项

1. 为了防止RNase降解RNA，提取过程使用的所有试剂耗材都要经过去RNase处理。
2. 提取过程中要带口罩、手套，避免讲话，动作迅速，减少样品暴露在空气中的时间。
3. 提取的RNA最好分装多管保存，方便后续实验使用，减少反复冻融。
4. 琼脂糖凝胶电泳所用的TAE需要用DEPC水配制，电泳槽、制胶板需要4 mol/L NaOH浸泡4 h，以出去RNase，防止电泳过程中RNA降解。
   

溶液配方

1. DEPC水
   在通风橱中 (DEPC易挥发，有剧毒，带口罩、手套，做好防护)，往配DEPC水专用的5 L带盖广口瓶中倒入5 L双蒸水，加5 ml DEPC (终浓度千分之一)，加入磁力搅拌转子，将广口瓶放在磁力搅拌器上，搅拌混匀过夜 (至少8 h)。然后在通风橱中将5 L DEPC水分装到1 L的蓝盖瓶中，121 °C、30 min灭菌后备用 (高温高压可使DEPC分解，失去毒性)。
   
2. 3 mol/L NaAc (pH = 5.2)
   24.6 g无水NaAc或40.8 g NaAc·3H₂O，加40 ml DEPC水溶解，定容到100 ml。用固体NaOH和冰醋酸调pH至5.2，121 °C、15 min灭菌后备用
   
3. Trizol Buffer
   

   异硫氰酸胍	59.08 g
   硫氰酸铵	38.06 g
   水饱和酚 (下层)	190 ml
   3 mol/L NaAc	16.7 ml
   甘油	25 ml
   8-羟基喹啉 (有异味)	0.5 g
   DEPC水	100 ml

   配好后用力振荡 (10 min) 混匀定容至500 ml，4 °C避光保存
   
4. 75%乙醇
   375 ml无水乙醇和125 ml DEPC水混匀，-20 °C保存备用
   
5. 1 mol/L Tris-HCl (pH 7.6)
   12.1 g Tris Base溶解于80 ml DEPC水，再加入约6 ml HCl，用DEPC水定容至100 ml，调pH至7.6
   
6. 0.5 mol/L EDTA
   18.7 g EDTA二钠加入80 ml DEPC水中，边搅拌边加入固体NaOH，当EDTA二钠和NaOH完全溶解，溶液变清，用DEPC水定容至100 ml，调pH至8.0，121 °C、15 min灭菌后备用
   
7. 10% Sarcosy
   10 g Sarcosy溶解于80 ml DEPC水中，定容至100 ml，121 °C、15 min灭菌后备用
   
8. TESAR
   

   1 mol/L Tris-HCl	1 ml
   0.5 mol/L EDTA	200 μl
   10% Sarcosy	10 ml
   加DEPC水定容至100 ml

9. Aq/CTAB和Bu/CTAB
   150 ml正丁醇 (Bu) 和150 ml DEPC水充分混合，静置4 h分层后，上层为水饱和Bu，下层为Bu饱和水。吸取100 ml上层水饱和Bu和100 ml下层Bu饱和水都转移到另一RNase-free的250 ml蓝盖瓶中，加入3.68 g CTAB，剧烈振荡，静置分层 (过夜)。上层为Bu/CTAB，下层为Aq/CTAB，分别吸取出来分装到两个100 ml RNase-free的蓝盖瓶中备用
   
10. 0.2 mol/L NaCl
    1.17 g NaCl溶解于80 ml DEPC水中，定容至100 ml，121 °C、15 min灭菌后备用
    

参考文献

1. Liu, Y. Z., Liu, Q. and Tao, N. (2006). Efficient isolation of RNA from fruit peel and pulp of ripening navel orange (Citrus sinensis Osbeck). J Huazhong Agric Univ 25(3): 300-304. (in Chinese)