Citrus Protoplast Electrofusion

材料与试剂

1. 滤纸
   
2. 玻璃器皿 (90 mm)
   
3. 双圈定性滤纸 (中速)
   
4. 生根管
   
5. 刀片
   
6. 专用细胞培养皿
   
7. 玻璃离心管
   
8. 长吸管
   
9. 0.22 μm醋酸纤维微孔滤膜
   
10. 橡皮筋
    
11. 封口膜
    
12. 活性炭
    
13. 锡箔纸
    
14. 柑橘种子
    
15. 柑橘胚性愈伤
    
16. 75%酒精
    
17. 3% NaClO
    
18. NaOH
    
19. FDA
    
20. 纤维素酶R-10 (Yakult Honsha)
    
21. 离析酶R-10 (Yakult Honsha)
    
22. DMSO
    
23. Sucrose
    
24. 椰子汁20 ml
    
25. 6-Benzylaminopurine (6-BA) 
    
26. Kinetin (KT) 
    
27. Naphthalene acetic acid (NAA)
    
28. Indole-3-acetic acid (IAA)
    
29. KOH
    
30. KH₂PO₄
    
31. KNO₃
    
32. MgSO₄
    
33. CuSO₄
    
34. CaCl₂·2H₂O
    
35. NaH₂PO₄·2H₂O
    
36. 甘露醇
    
37. BH3营养液配制所需试剂：
    1)

    麦芽提取物
    
    2)

    蔗糖
    3)

    谷氨酰胺
    4)

    七水合硫酸镁
    
    5)

    磷酸二氢钾
    
    6)

    二水合氯化钙
    
    7)

    氯化钾
    
    8)

    水解酪蛋白
    
    9)

    碘化钾
    
    10)

    硼酸
    11)

    二水合钼酸钠
    
    12)

    五水合硫酸铜
    
    13)

    六水合氯化钴
    
    14)

    一水合硫酸锰
    
    15)

    乙二胺四乙酸
    
    16)

    七水合硫酸亚铁
    
    17)

    肌醇
    18)

    果糖
    19)

    核糖
    20)

    木糖
    21)

    甘露糖
    
    22)

    鼠李糖
    
    23)

    纤维二糖
    
    24)

    半乳糖
    
    25)

    丙酮酸钠盐
    
    26)

    柠檬酸
    
    27)

    苹果酸Malic acid
    
    28)

    延胡索酸Fumaric acid
    
    29)

    生物素
    
    30)

    核黄素
    
    31)

    叶酸
    32)

    对氨基苯甲酸
    
    33)

    氯化胆碱
    
    34)

    抗坏血酸
    
    35)

    泛酸钙
    
    36)

    维生素B1
    
    37)

    维生素B6 
    
    38)

    烟酸
    39)

    维生素A
    
    40)

    维生素D3
    
    41)

    维生素B12 
38. 培养基相关母液 (见溶液配方)
    1)

    肌醇储备液 (100x)
    
    2)

    甘氨酸储备液 (100x)
    
    3)

    微量储备液 (100x)
    
    4)

    Fe²⁺-EDTA储备液 (100x) 
    
    5)

    Vitamin储备液 (100x)
    
    6)

    大量储备液 (10x)
    
    7)

    6-BA储备液 (1 mg/ml) 
    
    8)

    KT储备液 (1 mg/ml) 
    
    9)

    IAA储备液 (1 mg/ml)
    
    10)

    NAA储备液 (1 mg/ml)
39. 培养基的配制 (见溶液配方)
    1)

    胚状体诱导培养基 
    
    2)

    胚状体增殖培养基
    
    3)

    固体培养基
    
    4)

    悬浮培养基 
    
    5)

    播种培养基
    
    6)

    生芽培养基
    
    7)

    生根培养基
    
    8)

    0.6 M EME培养基
    
    9)

    0.15 M EME培养基
    
    10)

    CPW13 (见溶液配方)
    
    11)

    CPW25 (见溶液配方)
    
    12)

    电融合液 (见溶液配方)
    
    13)

    BH3液体培养基 (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 酒精灯
   
2. 镊子
   
3. 三角瓶
   
4. 刀柄
   
5. 325目不锈钢过滤网筛
   
6. 超净台
   
7. 摇床
   
8. 培养箱
   

实验步骤

1. 材料的准备
   1.1

   愈伤亲本的准备
   胚性愈伤悬浮系建立：固体培养基上挑选继代20天左右生长旺盛，疏松，颗粒细小的胚性愈伤组织于液体悬浮培养基 (100 ml三角瓶)，120 rpm振荡培养，每两周继代一次，继代3代后，若悬浮愈伤状态良好，可用于原生质体分离。
   
   1.2

   叶肉亲本的准备
   无菌苗的培养：柑橘果实完全成熟时进行采摘，之后进行单果包装，贮存在4 °C冷库中备用。
   使用时从柑橘果实中取出种子并将种子表面的果肉洗掉，将种子浸泡在1 mol/L NaOH中10 min去除表面果胶，之后用蒸馏水清洗3次，洗除NaOH。然后剥除外种皮，用浓度为3% (w/v) 的NaClO浸泡消毒15 min左右，用无菌水清洗至少3次，直至无菌水变无色，避免残留的NaClO对种子造成毒害作用。
   用镊子将消毒好的种子置于垫有滤纸的玻璃皿上去除内种皮，并接种于MT播种培养基上，封口置于光下培养。光照培养一段时间后，待叶片完全转绿、长势旺盛，充分展开后，可以用于原生质体的提取。
   另外，除使用无菌苗提取原生质体以外，也可以采摘温室中的叶片。叶片采摘要选择嫩绿、成熟、无病虫害的叶片，采摘后先将叶片洗干净，然后在 2% (w/v) NaClO中浸泡消毒15 min左右，然后在无菌环境中用无菌水清洗6次，以免残留的NaClO对叶片产生毒害作用。 
2. 原生质体的分离
   2.1

   愈伤原生质体的分离：用长吸管吸取1 g (继代6-10天) 的愈伤组织于50 ml的三角瓶中，吸干悬浮培养基，先加入1.5 ml 0.6 EME，后加入等体积的酶液， 封口后置于28 °C、40 r/min恒温摇床遮光酶解15 h。
   
   2.2

   叶肉原生质体的分离：先加入1.5 ml 0.6 EME于50 ml的三角瓶中，之后用解剖刀将叶片切成0.1 cm的细条，及时放入预先加好的后1.5 ml 0.6 EME中，避免叶片失水，后加入等体积的酶液，封口后置于28 °C、40 r/min恒温摇床遮光 酶解16 h。 
3. 原生质体的纯化
   过夜酶解的原生质体经孔径为45 μm的不锈钢网筛去除未完全酶解的残渣,将滤液转移至无菌的10 ml玻璃离心管中，100 x g离心6 min，使原生质体沉于管底，去除上清液。之后向管内加入3 ml的CPW 13并用长吸管轻轻地吸打混匀，然后将液体吸出并缓慢加到事先加有6 ml CPW 26的10 ml离心管中，这一步骤动作一定要缓慢轻柔，避免产生太大冲击力，使CPW 13混合液悬浮于CPW 26液体上方，然后80 x g离心3 min进行界面梯度离心。完整的原生质体在CPW 13和CPW 26的分界面处出现一个清晰的环形带，其它杂质及少量原生质体沉于管底。
   注：如果此种情况下无法形成界面，则原生质体沉淀物用CPW13悬浮，用长吸管将其吸出置于另一个无菌的10 ml离心管中 (将长吸管垂直插入离心管中吸取原生质体，勿倾斜)，加入适量电融合液至6 ml并吸打混匀，100 x g离心6 min。去除上清液，加入适量的电融合液吸打混匀，在倒置显微镜下用血细胞计数板统计原生质体数目，然后用电融合液调整愈伤和叶肉原生质体的密度。一般来说，愈伤原生质体密度为1 x 10⁶个/ml，叶肉原生质体密度2 x 10⁶个/ml。
   
4. 原生质体活性检查：利用FDA (二乙酸荧光素) 进行柑橘原生质体活力检测
   4.1

   首先用电融合液重悬原生质体，吸取200 μl的原生质体悬浮液，置于事先包裹锡箔纸的1.5 ml离心管中，加入4.8 μl的5 mg/ml FDA，避光染色10 min。染色结束后吸出50 μl于载玻片上，在倒置荧光显微镜 (Olympus IX 71) 下观察。
   
   4.2

   从显微镜中可以看出：有活力的原生质体会发出绿色的荧光，统计绿色原生质体的数量。同一个视野中散发绿色荧光的原生质体数量与明场下完整原生质体的总量的比值即为原生质体活性。当比值大于80%时，则可用于融合等后续实验。
5. 原生质体融合-电融合法
   5.1

   将双亲原生质体用电融合液重悬，混合均匀 (胚性愈伤组织原生质体1 x 10⁶ 个/ml；叶肉原生质体2 x 10⁶个/ml)。
   
   5.2

   融合小池先用电融合液洗涤，以防原生质体聚集于电极两侧的角落里，然后取0.8 ml (FTC-03) 或1.6 ml (FTC-04) 原生质体混合液于环形融合小槽，融合小池中央加2滴电融合液用来保持湿度，封口膜封口。
   
   5.3

   将融合小池置于倒置显微镜载物台，插线静置。在倒置显微镜下观察，当大多数原生质体处于同一水平面时开始进行电融合 (此过程一般需要5-10 min)。
   
   5.4

   电击结束后，静置15-20 min，等待融合的原生质体圆球化。
   
   5.5

   轻轻吸出融合产物于无菌的10 ml离心管，80 x g离心8 min，去上清液，培养密度为1 x 10⁵个/ml，常采用BH3液体浅层培养。
6. 融合细胞培养
   将融合细胞采用BH3液体浅层培养，随着原生质体的生长发育，期间不断降低渗透压。待细胞团变成淡黄色时，转移至胚状体诱导培养基中，进一步增殖，之后诱导其生芽生根。
   

结果与分析

融合细胞圆球化后，采用BH3液体浅层培养融合细胞。培养15 d后，培养皿中出现了肉眼可见的白色的小颗粒，此时降低渗透压至0.45 M。培养25 d后，培养皿中出现较大细胞团，此时降低渗透压至0.3 M。培养至35 d后时，培养皿中出现致密的淡黄色小颗粒，将其转移至胚状体诱导培养基中，固液共培，弱光下继续培养，待胚状体长出转移至胚状体增殖培养基，胚状体迅速壮大、转绿。随后将长势良好的胚状体转移至生芽培养基继续培养，当再生芽长至有3-4片叶时，将其从胚状体上切下并转至生根培养基诱导生根。再生完整根系后，挑选根系健壮、生长势好的再生苗炼苗2周，最后移栽到温室。

注意事项

1. 融合亲本状态最佳：悬浮细胞继代一周后状态最好，叶肉则在叶片充分成熟、展开，叶色浓绿时状态最好。
   
2. 提取原生质体过程中，动作一定要轻缓，慢速。
   
3. 原生质体融合过程中，叶片密度:愈伤密度 = 2:1。
   

溶液配方

一、培养基相关母液

1. 6-BA储备液 (1 mg/ml)
   6-BA 100 mg加入1.0 ml 1 M KOH搅拌至6-BA完全溶解，然后加蒸馏水定容到100 ml，4 °C保存
   
2. KT储备液 (1 mg/ml)
   KT 100 mg加入1.0 ml 1 M KOH搅拌至KT完全溶解，然后加蒸馏水定容到100 ml，4 °C保存
   
3. IAA储备液 (1 mg/ml)
   IAA 100 mg加入1.0 ml 1 M KOH搅拌至IAA完全溶解，然后用蒸馏水定容至100 ml，4 °C避光保存
   
4. NAA储备液 (1 mg/ml)
   NAA 100 mg加入1.0 ml 1 M KOH搅拌至NAA完全溶解，然后用蒸馏水定容到100 ml，4 °C避光保存
   
5. 5 mg/ml FDA储备液
   FDA5 mg溶解于1 ml DMSO中，用1.5 ml离心管装，-20 °C避光保存
   
6. 1 M KOH储备液
   KOH 5.6 g用100 ml蒸馏水溶解，室温保存
   

1. 大量储备液
   
2. 微量储备液
   
3. 铁盐储备液
   
4. 肌醇储备液
   
5. 甘氨酸储备液
   
6. 维生素储备液
   
7. CPW盐储备液

   CPW stock I母液
   KH2PO4	0.272 g
   KNO3	1.0 g
   MgSO4	2.5 g
   KI	0.002 g
   CuSO4	0.00003 g

   加蒸馏水定容至水，定容至100 ml，-20 °C避光保存
   注：
   1)

   配CPW stock I时，由于100 ml只需加KI 0.002 g，故先称取0.2 g溶于1 ml蒸 馏水中，配成100x母液，使用时取10 μl。
   
   2)

   配CPW stock I时，由于100 ml只需加CuSO₄ 0.00003 g, 故先称取0.006 g CuSO₄ 溶于2 ml，配成100x母液，使用时取10 μl。
   CPW stock II母液：CaCl₂ 1.5 g溶解于蒸馏水，定容至100 ml，-20 °C避光保存
   
8. 酶母液储备液

   CaCl2·2H2O	3.6 g
   NaH2PO4·2H2O	0.14 g

   溶解于蒸馏水，定容至100 ml，-20 °C避光保存
   
9. CaCl₂储备液 (100x)
   CaCl₂ 0.2775 g溶解于蒸馏水，定容至100 ml，4 °C避光保存
   
   

二、培养基的配制

1. MT固体培养基、悬浮培养基、播种培养基详见柑橘组织培养常用培养基配制方法。
   
2. 0.6 mol/L EME培养基 (200 ml)

   肌醇储备液 (100x)	2 ml
   甘氨酸储备液 (100x)	2 ml
   微量储备液 (100x)	2 ml
   Fe2+-EDTA储备液 (100x)	2 ml
   Vitamin B储备液 (100x)	2 ml
   Vitamin C储备液 (100x)	2 ml
   大量储备液 (10x)	20 ml
   Sucrose	41.04 g
   Malt Extract	0.1 g

   加蒸馏水定容至200 ml，调pH至5.8，高压灭菌
   
3. 0.15 M EME培养基 (200 ml)
   

   肌醇储备液 (100x)	2 ml
   甘氨酸储备液 (100x)	2 ml
   微量储备液 (100x)	2 ml
   Fe2+-EDTA储备液(100x)	2 ml
   Vitamin B储备液 (100x)	2 ml
   Vitamin C储备液 (100x)	2 ml
   大量储备液 (10x)	20 ml
   Sucrose	10.26 g
   Malt Extract	0.1 g

   加蒸馏水定容至200 ml，调pH至5.8，高压灭菌
   
4. 胚状体诱导培养基
   

   肌醇储备液 (100x)	10 ml
   甘氨酸储备液 (100x)	10 ml
   微量储备液 (100x)	10 ml
   Fe2+-EDTA储备液(100x)	10 ml
   Vitamin B储备液 (100x)	10 ml
   Vitamin C储备液 (100x)	10 ml
   大量储备液 (10x)	100 ml
   Sucrose	50 g
   Malt Extract	0.5 g

   加蒸馏水定容至1,000 ml，调pH至5.8，高压灭菌
   
5. 胚状体增殖培养基
   

   肌醇储备液 (100x)	10 ml
   甘氨酸储备液 (100x)	10 ml
   微量储备液 (100x)	10 ml
   Fe2+-EDTA储备液(100x)	10 ml
   Vitamin B储备液 (100x)	10 ml
   Vitamin C储备液 (100x)	10 ml
   大量储备液 (10x)	100 ml
   Sucrose	50 g
   Malt Extract	1.5 g

   加蒸馏水定容至1,000 ml，调pH至5.8，高压灭菌
   
6. CPW13 (100 ml)

   CPW stock I	1 ml
   CPW stock II	1 ml
   甘露醇	13 g

   加蒸馏水定容至100 ml，调pH至5.8，高压灭菌
   
7. CPW25 (100 ml)
   

   CPW stock I	1 ml
   CPW stock II	1 ml
   蔗糖	25 g

   加蒸馏水定容至100 ml，调pH至5.8，高压灭菌
   
8. 酶1 (愈伤组织) (40 ml)

   纤维素酶R-10	0.48 g
   离析酶R-10	0.48 g
   甘露醇	5.1 g
   酶母液	4 ml

   加蒸馏水定容止40 ml，调pH至5.8，通过0.22 μm醋酸纤维微孔滤膜过滤灭菌
   
9. 酶2 (试管苗叶片) (40 ml)
   

   纤维素酶R-10	0.6 g
   离析酶R-10	0.6 g
   甘露醇	5.1 g
   酶母液	4 ml

   加蒸馏水定容止40 ml，调pH至5.8，通过0.22 μm醋酸纤维微孔滤膜过滤灭菌
   
10. 电融合液 (100 ml)

    甘露醇	12.75 g
    CaCl2 (100x) 母液	1 ml

    加蒸馏水定容止100 ml，调 pH 至 5.8，高压灭菌
    
11. 生芽培养基

    肌醇储备液 (100x)	10 ml
    甘氨酸储备液 (100x)	10 ml
    微量储备液 (100x)	10 ml
    Fe2+-EDTA储备液 (100x)	10 ml
    Vitamin B储备液 (100x)	10 ml
    Vitamin C储备液 (100x)	10 ml
    大量储备液 (10x)	100 ml
    1 mg/ml 6-BA	500 μl
    1 mg/ml KT	500 μl
    1 mg/ml NAA	100 μl
    Source	40 g
    Agar	8 g

    加蒸馏水定容至1,000 ml，调pH至5.8，高压灭菌
    
12. 生根培养基

    肌醇储备液 (100x)	10 ml
    甘氨酸储备液 (100x)	10 ml
    微量储备液 (100x)	10 ml
    Fe2+-EDTA储备液 (100x)	10 ml
    Vitamin B储备液 (100x)	10 ml
    Vitamin C储备液 (100x)	10 ml
    大量储备液 (10x)	50 ml
    1 mg/ml IBA	100 μl
    1 mg/ml NAA	500 μl
    Source	25 g
    Agar	8 g
    活性炭	0.5 g

    加蒸馏水定容至1,000 ml，调pH至5.8，高压灭菌
    
13. BH₃营养液配方
    
    加蒸馏水定容至1,000 ml，用KOH调pH至5.8，通过0.22 μm醋酸纤维微孔滤膜过滤灭菌
    

参考文献

1. 郭文武. (1998). 柑橘细胞电融合及其再生植株遗传变异研究[D]. 武汉: 华中农业大学图书馆.
   
2. 肖诗鑫. (2014). 柑橘胞质杂种创制及原生质体再生过程的细胞学研究[D]. 武汉: 华中农业大学图书馆.
   
3. 杨雯惠，解凯东，郭文武. (2018). 柑橘组织培养常用培养基配制方法. Bio-101 e1010184. Doi: 10.21769/BioProtoc.1010184.
4. Grosser, J. W., Gmitter, F. G., Louzada, E. S. and Chandler, J. L. (1992). Production of somatic hybrid and autotetraploid breeding parents for seedless citrus development. HortScience 27(10): 1125-1127.
5. Guo, W. W. and Deng, X. X. (1998). Somatic hybrid plantlets regeneration between Citrus and its wild relative, Murrayapaniculata via protoplast electrofusion. Plant Cell Rep 18(3-4): 297-300.