A Protocol to Determin Auxin Polar Transport Tate

材料与试剂

1. 1.5 ml管子
   
2. 滤纸
   
3. 记号笔
   
4. 水稻植株
   
5. H³标记的IAA (Amersham, catalog number: TRK-781)
   
6. Phytogel
   
7. 生长素极性运输抑制剂TIBA (Sigma, catalog number: T5910)
   
8. 液闪缓冲液 (见溶液配方)
   
9. ½ MS液体培养基 (见溶液配方)
   
10. ½ MS固体培养基 (见溶液配方)

仪器设备

1. 液闪仪
   
2. 摇床

实验步骤

1. 取水稻抽穗期的第一节间，截取底端2 cm，每0.5 cm标记一次 (一定要严格区分顶端和底端)，放入½ MS液体培养基(pH 5.8)中于摇床上, 100 rpm, 2 h以脱去内源的生长素。
   
2. 用滤纸吸干后，将顶端和底端 (分别测量向基和向顶运输能力) 插入预先准备的20 μl含有100 nM的H³-IAA和0.35% phytogel的½ MS固体培养基中(1.5 ml管子)，盖好盖子。
   
3. 向基运输做两组，一组正常进行，另外一组，在½ MS固体培养基中还加入10 μM的TIBA。
   
4. 上述处理材料在室温下暗处理3 h，然后从未插入培养基的另外一端截取0.5 cm长的茎秆片段，用½ MS液体培养基洗两次(15 min每次)，放入2 ml液闪液中漂洗16~24 h，用液闪仪测量放射强度,按照参考文献中的计算方法将信号值转换为运输速度 (Lewis and Muday, 2009)。

注意事项

1. 在脱去内源生长素的时候，要保证茎杆为垂直向上在摇床上慢摇。
   
2. 所用材料不宜过老。
   
3. 必须做向顶运输的对照，以排除检测到的信号值是因为IAA在茎杆中自由扩散而产生的。
   
4. H³为辐射距离非常短的同位素类型，且释放的是高速运动电子，不会穿透人体，但是必须保证不能跟皮肤直接接触，否则会因为潜在的内照射而不安全。H³的半衰期长达12年以上，因此实验过程中产生的所有废料必须妥善的处置。

溶液配方

1. ½ MS液体培养基，pH 5.8 
   先配制母液：
   1)

   MS_max solution

   NH4NO3	16.5 g/L
   KNO3	19.0 g/L
   KH2PO4	1.7 g/L
   MgSO4·7H2O	3.7 g/L
   CaCl2·2H2O	4.4 g/L

   2)

   MS_min solution

   KI	0.083 g/L
   H3BO3	0.62 g/L
   MnSO4·4H2O	2.23 g/L
   ZnSO4·7H2O	0.86 g/L
   Na2MoO4·2H2O	0.025 g/L
   CuSO4·5H2O	0.0025 g/L
   CoCl2·6H2O	0.0025 g/L

   3)

   ½ MS液体培养基配制
   取50 ml MS_max solution和5 ml MS_min solution，加入800 ml H₂O，用1 M KOH调节pH到5.8，定容到1 L。
   
2. ½ MS固体培养基
   在½ MS液体培养基中加入Phytagel 3.5 g/L加热融化后即得½ MS固体培养基。
   
3. 液闪缓冲液
   (2,5-二苯基恶唑) (PPO) 5 g/L；1, 4-双-(4’-甲基-5-苯基恶唑) (POPOP) 0.2 g/L，用甲苯溶解。

参考文献

1. Lewis, D. R. and Muday, G. K. (2009). Measurement of auxin transport in Arabidopsis thaliana. Nat Protoc 4(4): 437-451.