Determination of ACC Content in Rice Tissues

材料与试剂

1. 1.5 ml离心管
   
2. 各种型号的枪头
   
3. 冰
   
4. 液氮
   
5. 氮气
   
6. 甲醇
   
7. D²ACC
   
8. NaOCl
   
9. NaOH
   
10. 10 mM HgCl₂
    
11. 5% NaOCl:饱和NaOH = 2:1 (v/v) (见溶液配方)
    
12. 抽提液 (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 离心机
   
2. 天平
   
3. 玻璃瓶
   
4. 气相色谱 (岛津)
   
5. 脱色摇床
   
6. 氮吹仪 (Dry N-EVAPTM111, Organomation Associates Inc. USA)
   
7. -70 °C冰箱
   

实验步骤

1. 取样
   液氮取水稻叶片，每份样品三个生物学重复，每份样品大约0.1 g鲜重，-70 °C保存直到抽提，避免反复冻融。
   
2. 抽提
   2.1

   液氮研磨，磨碎；取约0.1 g于1.5 ml管中，加750 μl抽提液，颠倒混匀，置冰上，避光。
   
   2.2

   4 °C、脱色摇床300 rpm避光抽提4小时；4 °C、13,000 rpm离心10分钟，吸上清于一新离心管中。
   
   2.3

   在沉淀中加入450 μl抽提液，4 °C、脱色摇床300 rpm避光抽提4小时，4 °C、13,000 rpm离心10分钟，吸上清，合并两次上清于玻璃瓶中。
   
   2.4

   氮气吹干，加入390 μl纯水定容(检测ACC一般不用纯化)。
   
   2.5

   在冰上加入10 μl 10 mM HgCl₂。
   
   2.6

   在冰上加入100 μl 5% NaOCl:饱和NaOH = 2:1(v/v)，放冰上3分钟
   
   2.7

   气相色谱火焰检测器检测。

注意事项

1. 抽提液配成mixture，-20 °C保存长期使用。
   
2. 所用试剂5% NaOCl:饱和NaOH = 2:1 (v/v) 及10 mM HgCl应4 °C保存，使用前应置于冰上。
   
3. 所用试剂除D²ACC购置于OlChemIm，其余均为国药试剂。
   
4. 抽提过程注意避光和低温。
   

溶液配方

1. 抽提液
   80%甲醇
   加5 ng/μl D²ACC (H²标记的ACC做内标)
   
2. 5% NaOCl:饱和NaOH = 2:1 (v/v)
   注：氢氧化钠饱和溶液：称取120 g氢氧化钠，加100 ml水，振摇使之溶解成饱和溶液，冷却后置于聚乙烯塑料瓶中，密塞，放置数日，澄清后备用。