Histone Extraction from Rice

材料与试剂

1. 1.5 ml进口离心管
   
2. 50 ml 离心管
   
3. 各种型号枪头 (20 μl, 200 μl, 1 ml)
   
4. Miracloth (Calbiochem, catalog number: 475855)
   
5. Protease Inhibitor (Roche, catalog number: 11836153001)
   
6. 水稻样品
   
7. 液氮
   
8. 三氯乙酸 (国药集团)
   
9. 丙酮 (国药集团)
   
10. EDTA
    
11. HCl
    
12. DTT (Sigma, catalog number: D0632)
    
13. 组蛋白抽提缓冲液 (见溶液配方)
    
14. 100%三氯乙酸 (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 移液枪
   
2. 量筒
   
3. 超净工作台
   
4. 通风橱
   
5. 天平
   
6. 干浴锅
   
7. 高速冷冻离心机
   

实验步骤

1. 取50 ml离心管，加入20 ml预冷的组蛋白抽提缓冲液，置于冰上待用。
   
2. 液氮研磨样品，取2 g粉末加入到抽提缓冲液中，充分混匀，用单层的Miracloth (Calbiochem)过滤掉残渣 (视频1)。
   
   
   
   视频1. 样品匀浆后单层Miracloth过滤
   
   
3. 4度冷冻离心，12,000 x g离心10分钟。
   
4. 取16 ml上清于另一离心管中，加入4 ml的100%三氯乙酸 (视频2)。
   
   
   
   视频2. 样品上清转移及三氯乙酸沉淀蛋白
   
   
5. 混匀后17,000 x g冷冻离心30分钟 (转速较高，注意选择进口的离心管)。
   
6. 弃上清，用1 ml左右-20 °C预冷的丙酮洗涤沉淀 (管壁上也有一层乳白色的沉淀，注意一并洗下，避免丢失) 并转移到1.5 ml进口离心管中 (视频3)。
   
   
   
   视频3. 丙酮沉淀蛋白
   
   
7. 12,000 rpm冷冻离心10分钟，弃上清。
   
8. 重复步骤6、7两次，每次洗涤时要注意把沉淀彻底打碎，重悬沉淀。
   
9. 弃上清，置于超净台吹干或通风橱中让丙酮挥发至沉淀如粉状。
   
10. 加入适量1x Laemmli buffer (一般2 g样品对应200-300 μl)，室温溶解过夜 (视频4)。
    
    
    
    视频4. 蛋白溶解
    
    
11. 溶解后的样品置于95度以上干浴中10分钟，离心取5 μl左右样品15% SDS-PAGE检测，会发现有很多蛋白条带，位于14-17KD的位置有几条比较明显的条带，组蛋白即包含其中 (见图1)。
    
    
    图1. 组蛋白SDS-PAGE电泳胶图
    

注意事项

1. 通常用于沉淀蛋白的三氯乙酸终浓度是10%-20%，尤其适用小分子量的蛋白。
   
2. 三氯乙酸固体极易吸水潮湿，注意干燥保存。
   
3. 丙酮具有较强的腐蚀性和挥发性，因此操作时需要在通风橱中进行，并避免沾到手上。
   

溶液配方

1. 组蛋白抽提缓冲液
   
   
2. 100%三氯乙酸
   称取100 g三氯乙酸固体(TCA)，加水溶解至100 ml