Reverse Transcription of mRNA to cDNA

材料与试剂

1. 0.6 ml及1.5 ml tubes (AXYGEN)
   
2. 20 µl、200 µl及1 ml tips (AXYGEN)
   
3. 0.5 M EDTA
   
4. DEPC (diethyl pyrocarbonate) (Sigma, catalog number: 40718)
   
5. ddH₂O (DEPC treated and steriled)
   
6. DNase I (Amplification Grade, Invitrogen, catalog number: 18068-015)
   
7. oligo d(T)₁₅ (Promega, catalog number: C110A)
   
8. SSIII DOUBLE STRANDED CDNA SYTH KIT (Invitrogen, catalog number: 18080-044)
   
9. RRI (Takara, catalog number: 2313A)
   
10. Ubiquitin引物 (F引物: AACCAGCTGAGGCCCAAGA; R引物: ACGATTGATTTAACCAGTCCATGA)

仪器设备

1. 水浴锅
   
2. 离心机
   
3. PCR仪
   
4. 计时器
   
5. 分光光度计 (测量RNA浓度和质量)

实验步骤

1. 取5 µg总RNA至新的不含RNase的0.5 ml或者1.5 ml离心管中，加入1 µl DNase I，1 µl 10x缓冲液，加DEPC处理过的水至总体积10 µl，混匀后短暂离心，25 °C (室温) 孵育15 min。
   
2. 加入1 µl 0.5 M EDTA，混匀后短暂离心，65 °C水浴10 min灭活DNase I。
   
3. 加入1 µl oligo d(T)₁₅，dNTP 1 µl，65 °C水浴10 min，然后立即置冰上3 min，短暂离心。
   
4. 加入5x First strand buffer 4 µl，DTT 1 µl，反转录酶 SSIII 1 µl，RRI 1 µl混匀后短暂离心，于50 °C水浴反应2 h。
   
5. 75 °C水浴灭活15 min。
   
6. 按每µg起始RNA量终体积20-30 µl加水稀释反转录得到的cDNA。
   
7. 检测反转录效果可用Ubiquitin引物做PCR扩增，判断有无基因组污染及浓度。

注意事项

1. 实验前应确定RNA浓度及质量, RNA吸光值比例OD₂₆₀/OD₂₈₀ > 1.8和OD₂₆₀/OD₂₃₀ > 1.8才可以进行反转录操作。
   
2. 在实验前应注意酶单位及反应条件，此实验所用酶可用其它公司产品代替，但单位及反应条件可能不同。
   
3. 步骤3需要防止复性，RNA易产生高级结构，影响反转录效果。
   
4. 反转录产物为单链cDNA，-20 °C保存，减少反复冻融次数，可以使用一年以上。