Extraction of Total RNA from Rice Endosperm

材料与试剂

1. RNase free离心管
   
2. RNase free枪头
   
3. 水稻种子
   
4. 液氮
   
5. 无水乙醇
   
6. 苯酚 (上海生工分装进口试剂，Tris-HCl饱和，pH 7.9)
   
7. 氯仿 (国药集团)
   
8. NaAC (Sigma, catalog number: 25022)
   
9. 尿素 (Sigma, catalog number: U1250)
   
10. 盐酸胍 (Sigma, catalog number: G4505)
    
11. EDTA (Sigma, catalog number: E5134)
    
12. HEPES (pH 7.0) (Sigma, catalog number: H7006)
    
13. 抽提缓冲液 (见溶液配方)
    
14. 3 M NaAC (pH 5.2) (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 冷冻离心机
   
2. 振荡器
   
3. 超净工作台
   

实验步骤

1. 在RNase free的离心管中加入600 μl抽提缓冲液，放在冰上预冷。
   
2. 将胚乳放在液氮中研磨成粉末，取适量加入到抽提缓冲液中 (视频1)。
   
3. 剧烈振荡 (同抽提普通组织RNA，非振荡器上混匀) 10秒 (视频1)。
   
4. 快速加入400 μl苯酚和200 μl氯仿，剧烈振荡 (同抽提普通组织RNA，非振荡器上混匀) 后放在冰上10-30分钟 (视频1)。
   
   
   
   视频1. 水稻胚乳样品研磨及RNA的抽提
   
   
5. 12,000 rpm冷冻离心30分钟。
   
6. 转移上清至新的离心管中，加入等体积的无水乙醇，混匀后置于-20度1-2小时。
   
7. 12,000 rpm冷冻离心15分钟。
   
8. 弃上清，用75%乙醇洗涤后超净台吹干，加入500 μl DEPC水溶解。
   
9. 加入250 μl苯酚混匀后再加入250 μl氯仿，剧烈振荡。
   
10. 12,000 rpm冷冻离心20分钟。
    
11. 转移上清 (400 μl左右) 至新的离心管，加入1/10体积的3 M NaAC(pH 5.2)和2倍体积的无水乙醇，-20度放置1小时以上 (或者-70度30分钟以上)。
    
12. 12,000 rpm冷冻离心20分钟，75%乙醇洗涤后超净台吹干，加入适量DEPC水溶解。

溶液配方

1. 抽提缓冲液
   
   
2. 3 M NaAC (pH 5.2)
   固体配制，用冰醋酸调节pH至5.2
   

注意事项

操作要求与普通RNA抽提相同。该方法改造自Yang et al. (2006)中马铃薯RNA的抽提方法。

参考文献

1. Yang, J. W., Song, B. T., Li, Y. J. and Liu, J. (2006). A simple and efficient method for RNA extraction from patato tuber. Journal of Agricultral Biotechnology 14: 297-298.