Introduction of RMD (Rice Mutant Database) and Genotyping of Rice Mutant

材料与试剂

1. 2 ml离心管
   
2. PCR管
   
3. 各种型号吸头 (20 μl, 200 μl, 1 ml)
   
4. 75%乙醇
   
5. Primers
   载体左端测序引物：NTLB5 5’>AATCCAGATCCCCCGAAT TA<3’
   载体右端测序引物：PFRB4 5’>TGCAGGTTCTCTCCA AAT<3’
   

仪器设备

1. PCR仪
   
2. 移液器
   
3. 超净工作台
   
4. 电泳装置
   

实验步骤

一、RMD水稻突变体相关信息
背景介绍：突变体对于遗传学研究有着重要作用，随着拟南芥和水稻等物种全基因组测序的开展，人类积累了前所未有的基因序列信息，为了弄清这些基因序列的生物学信息，寻找该基因区段序列发生变异的突变体是阐释基因功能最直接最有效的方法。
植物在自然的环境条件下也会产生突变性状，早期普通正向遗传学研究往往通过寻找与某种生物学特性相关的突变体来发掘或定位某个特定基因。为配合植物功能基因组研究高通量的策略，构建水稻等物种的大型突变体库已成为必然，借助水稻全基因组测序信息、通过反向遗传学的手段大规模地筛选突变体库，理论上可以获得基因组中任一基因的突变体，最终实现阐释基因功能的目的。
突变体构建原理：

1. 农杆菌介导的T-DNA插入
   农杆菌是寄主范围非常广泛的土壤杆菌，它能通过伤口侵染植物导致冠瘿瘤和毛状根的发生。1974从根癌农杆菌中分离出一种与肿瘤诱导相关的质粒，称为致瘤质粒(Tumor-inducing plasmid)，简称Ti质粒。Ti质粒上存在一段DNA，能够转移并整合到植物基因组中，称为Transferred DNA，简称T-DNA。
   研究发现，T-DNA两端存在非常保守的同向重复的25bp序列，分别称为左边界(LB)和右边界(RB)。T-DNA的转移只与边界序列相关，尤其是RB，而与T-DNA区段的其它基因或序列无关。我们将T-DNA区段上的致瘤基因和其它无关序列去掉，利用其转移的特性，实现农杆菌介导的T-DNA转入水稻愈伤，从而构建水稻突变体库。大量研究表明，农杆菌T-DNA整合到植物基因组中的位置是随机的，并且整合到植物基因组中的T-DNA能稳定遗传。由于插入到植物基因组中的T-DNA区段序列已知，这样随机插入到植物基因组中的T-DNA类似于给植物基因“贴”了一个序列标签。我们利用这个标签，通过各类PCR技术最终可以获取其插入的位点。
   
2. 水稻Tos17反转录转座子
   创造水稻突变体的另一种方法是利用植物的反转录转座子，它们是以DNA→RNA→DNA的方式进行转座，在水稻上已发现大约40种长未端重复的反转录转座子，它们是Tos1-Tos32，RIRE1-RIRE8，其中5类被证明是有转座活性的，分别是Tos10、Tos17、Tos19、Tos25和Tos27。这些反转录转座子只有在组织培养条件下才具备转座活性，其中Tos17的转座活性最强，容易插入到富含基因的区域，因此可以直接用于创造插入失活的突变体库。利用含有Tos17插入的水稻突变体库，可以进行突变性状的筛选。
   Tos17反转录转座子正成为水稻功能基因组研究的一个有力工具。由于Tos17反转录转座子为水稻内源的转座子，不需要进行转基因的过程，而且平均每株含有8个Tos17个拷贝，在正常情况下能够稳定遗传，因此Tos17转座子突变体库是水稻功能基因组研究的一个有用资源。但也有研究表明，Tos17在转座过程中存在几类转座热点，它容易插入到与抗病相关基因及蛋白激酶基因中。同时，Tos17插入突变体库中观察到的突变体大约只有10%的突变是真正由于Tos17插入造成，另外的突变可能是由于组织培养过程中体细胞变异造成的，也有可能是组织培养激活了其它类的转座子发生转座所致。
   
3. 水稻突变体库功能
   由于T-DNA在植物基因组中能稳定遗传，且拷贝数较低，对于突变体的遗传分析较容易。加之T-DNA序列已知，一旦发现某个突变性状与T-DNA共分离，则采用Tail-PCR、Inverse-PCR或质粒拯救等方法很容易分离T-DNA侧翼植物基因组序列。欲寻找某个基因的突变体，可以设计相应引物，采用Pool-PCR的方法高通量地筛选突变体库。
   另外，通过构建T-DNA侧翼序列数据库，也可以大规模地寻找基因的突变体。采用Tail-PCR的方法分离T-DNA插入突变体库的侧翼序列，有助于将T-DNA插入位点在染色体上定位，寻找已知基因不同区段的突变体。此外，在T-DNA区段构建Gene trap、Enhance trap等元件后，还可通过检测报告基因来反映靶位点基因的表达模式。
   
4. 遗传转化体系建立
   农杆菌介导的转化主要依据Hiei 等 (1994)的水稻转化方法并有所改动。简单流程如下：
   
   粳稻品种愈伤组织诱导/继代、预培养/共培养及筛选培养基用N6培养基，分化和生根用MS培养基具体参见“农杆菌介导粳稻遗传转化”(陈秋红等，2018)。
   
5. 突变体库转化植 株的编号
   为了便于突变体库产生的所有信息如植株种子、T-DNA侧翼序列、报告基因的表达模式等的统一管理，本研究中水稻突变体库的管理参照统一的数据库管理和编号方法进行，如编号“01Z11AB90”，“01”表示该突变体产生的年份为2001年；“Z11”表示转化的野生型亲本为中花11号，中花15的编号则为“Z15”，“AB”表示不同英文字的组合，代表不同的区号；“90”为阿拉伯数字编号，表示同一小区内的顺序号，编号范围为“01-96”。
   
   

二、RMD水稻突变体基因型鉴定

1. 水稻突变体发芽
   由于突变体发芽率会普遍降低，我们建议发芽的方法是：首先取10-20粒突变体种子，采用常规催芽的方法，若最后突变体发芽率高于60%的，即可将余下的种子进行常规催芽。如果发芽率偏低，我们建议您采用组培发芽 [具体方法见“组培水稻种子”(李燕等，2018)]。
   
2. 突变体DNA的快速提取
   突变体长到三叶一心后移栽至田间，移栽2-3天后可取叶片快速提取DNA [参见方法“水稻DNA小样抽提”(凌飞等，2018)] 用于基因型的鉴定。
   
3. 突变体基因型鉴定
   3.1

   构建水稻突变体载体介绍
   T-DNA突变体库我们一共用过3个载体：pFX，pSMR和pEGFP。它们在结构上没有差别，仅在报告基因位置存在差异(图1中蓝框)，其余位置完全一样。因此，无论是哪个载体，鉴定基因型的步骤都是一样的。
   

   载体	报告基因
   pFX	GUS&GFP
   pSMR	GUS
   pEGFP	GFP

   
   
   图1. 构建水稻T-DNA突变体库所用载体图。图中斜线左侧为T-DNA。
   载体左端测序引物：NTLB5 5’ AAT CCA GAT CCC CCG AAT TA 3’
   载体右端测序引物：PFRB4 5’ TGC AGG TTC TCT CCA AAT 3’
   
   
   3.2

   基因型检测的原理
   对每个插入位点基因设计一对跨T-DNA或Tos17的基因组引物-Sense primer(S)和Antisense primer(AS)，通过这两条基因特异引物(S和AS)与一条载体上已的引物(primer A或primer B)进行配对扩增，就能确定后代的基因型(见图2)。
   
   
   图2. 基因型检测原理图
   

   
   

   1)

   如果T-DNA或Tos17在某位点的插入是纯合的，当用基因组上一条引物(S或AS)和载体引物进行配对扩增时，能够得到目的条带。但是由于T-DNA或Tos17的插入使两条基因组引物(S和AS)间距太大，所以用两条基因组引物S和AS不能扩增出条带；

   2)

   如果该位点没有T-DNA或Tos17插入，当用两条基因组引物(S和AS)扩增时能够得到目标条带，但用基因组上一条引物(S或AS)和载体引物配对扩增时不能得到目标条带；

   3)

   如果T-DNA或Tos17在某位点的插入是杂合的，则用两条基因组引物(S和AS)以及一条基因组引物(S或AS)和载体引物的配对扩增都能得到目标条带。
   3.3

   引物选择
   农杆菌T-DNA整合到植物基因组中的位置是随机的，可能出现正向插入和反向插入两种情况，同时我们分离侧翼序列时根据使用引物的不同，会分离到T-DNA左端侧翼序列和右端侧翼序列。当我们拿到感兴趣的突变体的编号后，如何选择合适的引物组合来进行基因型的鉴定呢？
   第一步，确定序列比对中的strand值
   具体方法是：将突变体的侧翼序列在NCBI上进行比对，比对结果中会出现一个strand值(如下图红框显示) (图3)：
   strand=Plus/Plus，代表我们分离到的侧翼序列与基因组正义链匹配；
   Strand=Plus/Minus，代表我们分离到的侧翼序列与基因组反义链匹配；
   
   
   图3. 判断strand值及确定匹配方向示意图
   
   但是，侧翼序列在基因组上的正反向并不能代表T-DNA在基因组上的的插入方向，我们还需要通过分析当初分离侧翼序列时使用的是T-DNA的左端还是右端的引物，来确定T-DNA在基因组上的的插入方向。
   
   第二步，确定侧翼序列是在T-DNA左端还是右端
   具体方法是：我们的突变体有统一的编号，前缀表示分离的方法等 (具体见RMD网站详细介绍)，后缀显示的是分离侧翼序列时所使用的引物 (见下图红框，测序时即可使用该引物) (图4)。如果我们使用引物NTLB5，代表分离得到的是T-DNA的左端序列，如果我们使用引物PFRB4，代表分离得到的是T-DNA的右端序列。
   
   
   图4. 侧翼序列标识图
   
   第三步，T-DNA在基因组上的的插入方向
   根据第一步和第二步的结论，我们即可确定T-DNA在基因组上的的插入方向，并选择合适的检测基因型的引物 (结论见表1，图5)。
   
   表1. T-DNA在基因组上的插入方向
   
   
   
   图5. T-DNA 插入方向示意图
   
   第四步，确定引物组合
   根据第三步的结论，我们可以选择引物组合进行基因型鉴定(见表2)。
   
   表2.基因型鉴定引物组合
   
   
   
   3.4

   举例说明
   鉴定基因型的步骤：

   1)

   用突变体的侧翼序列 (可在http://rmd.ncpgr.cn/ 查找)和水稻基因组比对 (推荐NCBI)，找到T-DNA插入位点。以03Z11AA66为例，其侧翼序列为： >Sequence1|Possible
   location: Chromosome 3 (by Zhang Jian)
   CGTCCGCAATGTACTCACCCGGCCTAGCATACGACCTGCTGCCTGTCTTGAGAACGCCACGAAGCGGCAGCCTGCATGTCGTTTACGAGGAGCCCTTAGATTCCCCTCCAGAATTAGGAGTACACGCCCTGTGTTGGTGTCGATCAATCGATAATGTAGATTGATCGCAATCGAGATGGGTGTTGATGAGCAGGATCATATCCATCCTCCTCTTGGGGGTTTCTCTGCAGGCTCCTGACAGACAATGAATGTGTGCACATGATCAATGCAGATGCGTGCAGCTATCGAAATCTTGGTTGGTACTTGTCCTGGATGGCTTGATTAGATTGTTAATACCAAAACACATTTTTTCGCTCATACTGATATACGAGTAGTAGTAGGACTTCCTCGTGAGCTCTCTTGAATTCATCTCACTCGACGA

   2)

   用该侧翼序列在NCBI上做BLAST，由BLAST结果可知以下信息 (如图6)：

   1. T-DNA插入为点为第三染色体5013391处，
      
   2. 该家系strand=Plus/Plus，
      
   3. 分离侧翼序列的引物为NTLB5 (TTL _03Z11AA66 _NTLB5)
      

   将b和c结果对应表应得知T-DNA是反向插入在基因组中。
   
   
   图6. 03Z11AA66侧翼序列NCBI Blast结果展示
   
   

   3)

   在插入位点(5013391)处，取前后1Kb的序列如下 (加粗为引物潜在区)：
   1 agcccaaccc gaccctgccc cgcctcgttg ccatccctag ctgcaacctc gggtgcccca
   61 ccagcgagca tgggcaattc cgtctcatca cccggtattc caacgaaaaa gatttcaaaa
   121 atgcacaaaa cgatcgaaat ggcaaagtga ctgtgagtac gcgcttcata ttgacatttt
   181 aacgaagcgt gtttttgaga tggcattcca atgatactgt tttttaaacc tggtcaaatg
   241 tccattttct agttcgggac ttcccagtcc tagccatgta gcctgagagc tgagatacac
   301 accccagcag tatcctgtgc aaggcatgat cgagtcgaat ccgtccctgc caatggcaca
   361 agtcttttca agggggtgtt tagcccctct cccccccccc ccccccctag ctagctggta
   421 gtggctggcg ctacgcatgc acaggcacgt cgcttcgccc gctgcgtgca tcatatgcat
   481 ccatccatct ggtctcctgt tttatggacg gacgggtcgc tgcacgggcg gtctgcacgc
   541 tgtcacgcgc agcctggcat acgggcttgt catatgtcaa agatgcagac acacacgaca
   601 caagagccag ttggggttgg gaggttgcgc gtagcctctt tcccacacgt gaccccctcc
   661 ctactctccc cactgccgcc acaacttacc aggatccatg cgagaatcgc accaaaaacg
   721 ccaccaatct cgtgaactcc accacctcca tcgtatcgcc cggcctttcc actagctagc
   781 agcctagcac acagctgatc gatcggcgaa gctagtcacg ccacggcgat gcgattatcc
   841 cggtgtcgtt tacgcggcgg ccgctagggt gtcggatggg ctatgtcgtc gtcgttgcca
   901 ctgcttgtgt gtgtaccaaa tcgggtgcgt tgtttcgact gttggtcgat gcgagtacct
   961 accgcatgtg atggacgggc ctgcaggcga cttgtcgatg gcaacgtact cacccggcct
   1021 agcatacgac ctgctgcctg tctcgtgaac gccacgaagc ggcagcctgc atgtcgttta
   1081 cgaggagccc ttagattccc ctccagaatt aggagtacac gccctgtgtt ggtgtcgatc
   1141 aatcgataat gtagattgat cgcaatcgag atgggtgttg atgagcagga tcatatccat
   1201 cctcctcttg ggggtttctc tgcaggctcc tgacagacaa tgaatgtgtg cacatgatca
   1261 atgcagatgc gtgcagctat cgaaatcttg gttggtactt gtcctggatg gcttgattag
   1321 attgttaata ccaaaacaca ttttttcgct catactgata tacgagtagt agtaggactt
   1381 cctcgtgagc tctcttgaat tcatgtgtgt cggagcggca gcgtcacacg ctgcgcccct
   1441 acgcattttt aggatctcag agcagtcatc agtcttcgtg tacctcagta ctttgaattc
   1501 tctttgcctg tagcagatgc tttttttttt tgacatgaat agcagatgca ttcactgtgc
   1561 attcccttcc cccttctctc gatcgacgcg acttacccgt atactgcatc actgcaaact
   1621 cacataaatt tacccgtgac cgtgtgcccg tgtgatcatc ctccaatcaa actgtccttc
   1681 ccttttcacc ttaaaaggac cggccggaac gcttctctca tcttccagtc gtactattac
   1741 agtccagtcg ccgcaatgga tggctggcat gtcaaagatg atgaattggt gatggtggca
   1801 cccggttgca cttgcgcccg cggctggcaa cgcggcatca cagatctcac acgcgcggac
   1861 taaaaaccga cgtgacaaca cggccgcggc caacgacgag accggccggt atgggagctt
   1921 gccgctgcat gcgacgtcga cgttgatgtg gccaagacac ggagcgttac gtatagtgcg
   1981 ctcgtacgca ggcgcgcatg c
   
   针对这段序列设计两条引物 (下图中AS，S，图7)，产物大小在800至1200bp之间 (建议在1Kb左右)，插入位点在产物中间位置 (距离产物两端400-600bp均可)。
   
   
   图7. 03Z11AA66 T-DAN在基因组上插入位置方向示意图
   
   对于03Z11AA66家系而言，则应该选择引物组合为：S+AS/AS+NTLB5或者S+AS/S+PFRB4，由于我们分离出的是左端序列，您一般用NTLB5来验证杂合、纯合，即选用组合S+AS/AS+NTLB5。当然也可以选择S+AS/S+PFRB4组合，特别是第一个组合扩增不出来的时候。
   
   

   4)

   使用引物检测基因型(条带位置根据你的引物而定) (图8)
   
   
   图8. 引物检测基因型电泳示意图 (W：野生型，H：杂和型，M：纯和型)
   
   
   3.5

   对于Tos17反转录转座子的突变体，检测原理与T-DNA插入突变体基因型检测原理步骤是一致的，引物选择如下表3：
   
   表3. Tos17反转录转座子突变体检测引物组合
   
   

参考文献

1. 陈秋红，陈太钰. (2018). 农杆菌介导粳稻遗传转化. Bio-101 e1010174. Doi: 10.21769/BioProtoc.1010174. (in press)
2. 李燕，龙湍, 吴昌银. (2018). 组培水稻种子发芽. Bio-101 e1010183. Doi: 10.21769/BioProtoc.1010183.
   
3. 凌飞，吴昊. (2018). 水稻DNA小样抽提. Bio-101 e1010101. Doi: 10.21769/BioProtoc.1010101. (in press)
4. 吴昌银. (2003)．水稻T-DNA插入突变体库及其Enhancer trap系的创建．[博士学位论文]．武汉：华中农业大学图书馆.
   
5. Hiei, Y., Ohta, S., Komari, T. and Kumashiro, T. (1994). Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA. Plant J 6(2): 271-282.