A Rapid Method for Isolation of High-quality Total DNA Using 2 ml Centrifugal Tube

材料与试剂

1. CTAB (Bio Basic Inc., Canada)
   
2. NaCl (国药试剂)
   
3. EDTA (天津市天力化学试剂有限公司)
   
4. Tris (Angus Chemical Company, USA)
   
5. HCl (国药试剂)
   
6. RNase A (Invitrogen, USA)
   
7. β-巯基乙醇 (Sigma, USA)
   
8. 三氯甲烷 (国药试剂)
   
9. 异丙醇 (国药试剂)
   
10. 液氮 (武汉液氮厂)
    
11. 95%乙醇 (国药试剂)
    
12. CTAB抽提缓冲液 (见溶液配方)
    
13. TE缓冲液 (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 台式离心机 (Beckman, USA)
   
2. 电热恒温培养箱 (SKP-02.3000，黄石市恒丰医疗器械有限公司)
   
3. 冰箱 (BCD-243K F&R，新飞)
   

实验步骤

1. 在苗期收获适量水稻叶片于-20 °C冰箱保存备用。
   
2. 将叶片在液氮中磨碎，转移1/4到1/3管量的粉末到2 ml离心管中。
   
3. 向每管样品中加入800 μl CTAB抽提缓冲液，振荡1 min，65 °C温育10-15 min。
   
4. 加0.7倍体积三氯甲烷(600 μl)，剧烈振荡1 min。
   
5. 12,000 rpm离心10 min，将上清液(500 μl)转移的新的1.5 ml离心管中。
   
6. 加0.7倍体积异丙醇(350 μl)，颠倒混匀，12,000 rpm离心10 min。
   
7. 倒上清液，加70%乙醇1 ml洗沉淀。
   
8. 倒乙醇，在超净台上将沉淀吹干，加50 μl TE溶解。
   
9. 用1%(w/v)琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量(选做)。
   

注意事项

1. 用本法抽提的DNA质量较高，但有部分降解是正常现象 (图1)。一般主带处未降解的完整DNA浓度约为140-200 ng/μl (与上样量有关)。
   
   
   图1. 2 ml离心管法抽提的DNA电泳检测图
   
   
2. 在-70 °C超低温冰箱保存样品，磨样前叶片不冻融可以显著提高DNA质量。
   
3. 叶片粉末磨得越细，最后抽提到的DNA质量越好，产量越高。
   

溶液配方

1. CTAB抽提缓冲液
   2% (w/v) CTAB
   1.42 mol/L NaCl
   20 mmol/L EDTA
   100 mmol/L Tris, pH 8.0
   使用前加1/80体积RNase A, 0.2% (v/v) β-巯基乙醇
   
2. TE缓冲液
   10 mmol/L Tris, pH 8.0
   1 mmol/L EDTA